IGF1在脑缺血大鼠脑组织中的表达与通络救脑注射液的脑保护作用

目的:观察脑缺血模型大鼠血清及脑组织中IGF1蛋白表达水平,以及通络救脑注射液对该因子表达水平的影响,分析通络救脑注射液的脑保护作用途径。方法:以线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血模型(MCAO),将SD大鼠随机分为空白对照组、模型组及通络救脑注射药组,分别在造模后12小时、24小时、3天、7天4个时间点采取动物血清和脑组织,以免疫组化、酶联免疫(ELISA)以及RTPCR的方法,分别检测IGF1的表达部位及定量检测该因子的蛋白及mRNA表达水平,并测定血清NSE含量。结果:IGF1在正常脑组织有表达,在脑缺血后24小时表达增多,此后随脑缺血时间的延长不断减少;通络救脑组IGF1各时间点表达均高于模型组。模型组血清NSE水平显著升高,各时间点与正常组均有显著差异,通络救脑注射液组血清NSE水平在12小时、1天和7天时显著低于模型组。结论:大鼠脑缺血损伤后IGF1表达减少与神经元的坏死有相关性,通络救脑注射液能够提高其表达水平,对缺血损伤的脑组织发挥保护作用。     

微细胞介导人14号染色体自A9细胞转移至DT40细胞

为了获得含人14号染色体的DT40细胞,用于人抗体基因的表达研究.本研究利用微细胞介导的染色体转移技术,将A9细胞中的人14号染色体转移至DT40细胞中.首先,摸索秋水仙胺诱导A9细胞微核形成最佳浓度与最佳时间,以终浓度为10 mg/mL的细胞松驰素B破坏细胞骨架,离心分离微细胞,获得的微细胞依次经8μm、5μm、3μm滤膜过滤后与受体细胞DT40融合,细胞铺板后加入G418筛选.然后,对长出的抗性克隆进行基因组DNA检测及FISH杂交,分析人14号染色体在DT40杂合细胞克隆中的存在情况.结果显示,成功获得含人14号染色体的DT40(#14)细胞,三轮试验共获得抗性克隆30个,人14号染色体有效转移率为1×10-6.实验结果表明,人14号染色体完整的自A9细胞转移至DT40细胞,获得的DT40(#14)细胞可用于制备含人抗体基因的人类人工染色体,用于人抗体基因的表达研究.     

逆境下拟南芥野生型和突变体sex1游离态水杨酸含量及根形态差异

以拟南芥野生型(WT)和突变体sex1为材料,采用HPLC、显微观察等方法,研究了WT在10个不同生长期时游离态水杨酸(SA)含量的变化,比较了在丁香假单胞菌番茄致病变种(Pst.DC3000)、H2O2、甲基紫精(MV)和SA处理环境下WT和sex1中游离态SA含量及幼苗根形态的差异.结果表明:在花序继续开放期(6.30、6.50)以及长角果出现期(8.0),WT中游离态SA含量处在更低水平;2 mmol·L-1 SA处理能够极显著提高WT和突变体sex1中游离态SA的积累,且突变体sex1中游离态SA水平增加更明显,是其他处理游离态SA水平的10倍左右;在MV和H2O2处理下,WT和sex1主根生长受抑制的程度没有明显差异,而突变体sex1幼苗的根毛在低浓度MV环境中比WT更长但密度差异不明显,且WT和sex1根毛在低浓度H2O2环境中差异情况与对照组相似,但外源SA处理使WT和突变体sex1的主根生长均受到明显的抑制,两者的根毛密度随SA增加逐渐降低甚至消失,且突变体sex1比WT受到的抑制作用更明显.研究发现:拟南芥的开花和结果过程与SA依赖途径有一定关系;外源添加SA比Pst.DC3000、H2O2和MV处理更能直接促使拟南芥突变体sex1产生更多的游离态SA;突变体sex1根的生长发育比WT更易受到生长环境条件的影响,且sex1根形态的生长存在一定的SA浓度依赖模式.     

闽西北稻区"晚改中"避蚊减害技术研究与应用

针对闽西北海拔300-500m的单、双季水稻混栽区稻瘿蚊危害重、单季稻三代稻瘿蚊危害突出的情况,通过研究提出“晚改中”的依据和技术,在正常年份下,把以往5月份播种的单季稻的播种期提早到4月5日前,就可以有效地避开三代稻瘿蚊的危害,而不必提早到3月20日前,与农民农时操作习惯更吻合,农民更易接受采用。     

基于非结构蛋白1(NS1)的黄病毒感染诊断研究进展

蚊虫传播的黄病毒造成的传染病是人类健康的重要威胁,有效的早期精确诊断对预防与控制黄病毒感染并及时有效开展病患救治至关重要。然而由于黄病毒在血液中核酸可检测窗口短,核酸检测手段难以发挥优势,必须要通过血清学的诊断与病毒分离予以佐证,而血清学检测也要面对黄病毒之间存在的交叉反应问题。本文介绍了基于黄病毒非结构蛋白1(NS1)建立的检测手段。NS1蛋白在病人血清中含量很高是良好早期诊断靶标,基于NS1蛋白的黄病毒血清学诊断的检测窗口较长、灵敏度高、特异性强,具有独特的优势。尤其是2016年寨卡病毒暴发以来基于NS1的检测技术在灵敏度与特异性上得到快速与多元的发展,为黄病毒的精确检测带开启了新的局面。     

1-硝基-2-酰基蒽醌-缬氨酸通过抑制ERK1/2激活和ERCC1表达诱导结肠癌细胞死亡

化学方法合成是新药研发的一种重要途径。结合抗肿瘤药物的作用机制以及蒽醌类衍生物的构效关系,设计合成了一类新的蒽醌类衍生物1-硝基-2-酰基蒽醌-缬氨酸(简称C3),发现其具有很好的抗肿瘤活性。为了确定蒽醌类衍生物C3对结肠癌HCT116和HT29细胞的作用及其分子机制,首先通过MTT比色法检测C3对结肠癌HCT116和HT29细胞活性的影响。结果显示,C3对这两种结肠癌细胞具有明显的抑制作用,呈时间和剂量依赖性。60μg/mL的C3处理HCT116和HT29细胞48 h,细胞活性分别是50.67%和59.77%,达到了半抑制浓度;同时,其细胞形态和细胞核发生明显变化。进一步采用Western印迹和qRT-PCR技术,检测C3对DNA切除修复交叉互补1(excision repair cross-complementation group 1,ERCC1)转录水平和蛋白质水平表达及其稳定性的影响。结果表明,C3降低了ERCC1转录水平和蛋白质水平的表达,并且减弱了ERCC1转录水平和蛋白质水平的稳定性。最后,用U0126(MEK1/2抑制剂)和C3联合作用结肠癌HCT116和HT29细胞,通过Western印迹检测ERCC1蛋白质水平的表达。结果表明,C3通过降低p-ERK1/2的蛋白质水平的表达,从而抑制ERCC1的表达。上述结果证明,C3通过细胞外调节蛋白激酶(extracellular regulated protein kinases, ERK1/2)信号通路,降低了ERCC1转录水平和蛋白质水平的稳定性,使ERCC1转录水平和蛋白质水平表达发生下调,进而抑制结肠癌HCT116和HT29细胞的活性。     

利用CRISPR-Cas9技术敲除MAS1基因的质粒构建与酶切方案优化的研究

CRISPR-CAS9技术是新一代基因编辑技术,可简便快捷地对哺乳动物细胞进行指定基因的敲除,实现沉默外源基因表达的目的。但传统的CRISPR-CAS9技术提供的酶切方案没有特异性,致使酶切效率不稳定,影响胶回收率以及后续实验。本实验通过改变酶切体系大小,以及酶切反应时间,继而通过胶回收率及测序检测的方法验证最佳酶切条件,最后通过荧光定量PCR和Western blotting实验检测目的基因的表达量,确认是否成功敲除目的基因。研究结果说明:BbsⅠ酶与px459质粒比值为1μL:500 ng,酶切体系为50μL,酶切时间为45 min时,酶切效果最佳、胶回收率最高,且此时目的基因在细胞内的表达量为0,确定该实验条件下目的基因被成功敲除。     

靶向miRNA前体不同类型sgRNA的丰度及特异性评估

CRISPR/Cas技术能高效进行基因组定点编辑,但不同细菌来源或人工改造的Cas9以及Cpf1等核酸酶识别的PAM (protospacer adjacent motif)有差异,因此不同的基因编辑核酸酶可能采用不同类型的sgRNAs(small guide RNAs)。MicroRNAs (miRNAs)是一类调控性的小分子非编码RNAs,为了研究miRNA前体中是否可能存在特异性高的sgRNAs靶点,本文利用本课题组前期开发的生物信息学软件CRISPR-offinder,对靶向28 645条miRNA前体的11种不同类型sgRNA的丰度及特异性进行了分析,并利用CRISPR/Cas9慢病毒技术构建了猪miR-302/367基因簇敲除细胞系,对构建的猪miRNA敲除细胞系的效率进行了检测。结果表明,每个miRNA前体中平均存在约8种不同类型sgRNA的靶点;通过评估靶向猪miRNA前体sgRNA的脱靶效应,发现其中特异性高的sgRNA仅占18.2%;通过CRISPR/Cas9慢病毒技术成功构建了猪miR-302/367基因簇敲除细胞系,发现通过该技术构建miRNA敲除细胞系的效率为40%。本研究为利用CRISPR/Cas技术靶向敲除miRNA提供了重要资源。     

人巨细胞病毒对单纯疱疹病毒1型抗原表达的影响

我们用免疫胶体金色埋前标记技术和免疫荧光技术研究了人胚肺细胞(HEL)内,人巨细胞病毒(HCMV-AD_(169))对单纯疱疹病毒1型(HSV-ⅠSM_(44))抗原表达的影响,旨在探讨在细胞这一微生境内,一病毒对另一病毒可能发生的影响。电镜下计数HSV-1组和HCMV HSV-1组特异性结合金颗粒数得HSV-1组为657个,HCMV HSV-1组的总数为283个。t检验P<0.01,差别非常显著。并且HSV-1组细胞的胞浆中的病毒颗粒,比HCMV HSV-1组明显多。荧光显微镜下:HSV-1组阳性细胞数为689个HCMV HSV-1组只有484个,经poisson分布u检验,P<0.01,差别非常显著。免疫荧光实验还表明:HSV-1组,抗血清在1:320时仍有荧光清晰的阳性细胞,而HCMV HSV-1组,抗血清在1:160时,却无荧光阳性细胞。细胞病变效应(CPE)动态观察显示:HSV-1组8小时即有细胞病变,24小时蔓延整个单层;而HCMV HSV-1组超感染14小时才有细胞病变。24小时约有75％细胞受累。结果表明HCMV对HSV-1的抗原表达有明显的抑制作用。对抑制作用的可能机理及其在分子生态学中的意义,进行了讨论。     

丙型肝炎病毒NS2蛋白在Huh-7细胞中抑制NF—κB活性

将丙型肝炎病毒（HCV)非结构蛋白NS2基因的全长序列插入到真核表达载体pCDNA3．1(-)CMV启动子下游,构建成重组质粒pCNS2。用脂质体Lipo Vec^TM转染Huh-7细胞,转染细胞内可检出NS2的mRNA和蛋白质,表明构建的pCNS2可在Huh-7细胞内成功表达;把不同剂量的pCNS2质粒DNA与报告质粒pNF-κ B-Luc共转染Huh-7细胞,48h后检测荧光素酶活性,结果显示与pCNS2共转染的细胞中pNF-κB-Luc表达出的荧光素酶的活性比对照细胞降低了约2—4倍,并呈明显的剂量相关性。表明HCV NS2对NF-κ B激活转录活性有明显的抑制作用。这可能与HCV慢性持续性感染的致病性有一定的相关性。