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外部引导序列(EGS)技术(The EGS-based technology)是一种新型的基因沉默技术,能诱导内源性的核酶 P(RNase P)对靶mRNA进行有效切割. 以人类巨细胞病毒(HCMV)UL49基因mRNA片段为靶序列,基于前人实验基础上设计出更为精简与高效的改进型EGS (miniEGS),DNA片段长度仅为12 bp. 构建稳定表达HCMV UL49的细胞系,通过应用荧光定量PCR及Western 印迹分别鉴定miniEGS对内源性UL49的抑制效率.结果显示,miniEGS能在HeLa细胞中能达到很高的转染效率(97.9%),并且在转染稳定表达UL49的HeLa细胞系后,发现UL49基因的mRNA与蛋白表达水平都出现明显下降(50%).研究表明, 改进型的EGS序列不仅能有效抑制目的基因的表达,同时因其序列设计的精简性与高效性,可更好地应用到以后的抗病毒研究中. 相似文献
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利用T7RNA聚合酶(T7 RNA polymerase,T7 RNAP)的体外转录方法因其简便、高效而在RNA制备中得到广泛应用,但该法由于T7RNAP的启动子跨越转录起始位点而会导致转录产物多出附加序列;如果去掉T7启动子的转录起始位点,则会严重降低T7RNAP的转录活性。本实验很好地消除了以上弊端,将T7RNAP的高效转录系统与核酶高度专一的自剪切技术相结合,成功构建了一种不影响转录效率的体外转录方法,而且转录后核酶能够在设计的特定位点进行自剪切并释放出目的RNA,得到了活性达113.6pmol/μg的人线粒体色氨酸tRNA(HmtRNATrp(UCA))。该方法转录效率高、重复性好,适合RNA的大量精确制备。 相似文献
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针对HCV基因组中较为保守的区域-5'UTR,设计一段GS引导序列,并与大肠杆菌RNase P的催化亚基-M1RNA的3'末端共价结合,构建序列特异性M1GS核酶-M1GS-HCV/C20。体外实验证实,所构建的人工核酶对HCV 5'UTR具有明显的靶向切割活性,且这种切割发生于靶序列的特定位点。本研究将为进一步阐明该核酶在胞内的活性、乃至动物模型内评价其抗病毒效果提供实验材料,从而为新型抗HCV药物及反义基因治疗的研究奠定基础。 相似文献
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特异切割马铃薯纺锤形块茎类病毒负链的多价核酶的构建和体外活性测定 总被引:4,自引:0,他引:4
根据锤头型核酶的作用模式 ,设计、合成并克隆了特异切割马铃薯纺锤形块茎类病毒 (PSTVd)负链RNA不同区域位点的双价和三价锤头型核酶基因。通过体外转录 ,将PSTVd负链RNA分别与双价和三价核酶混合 ,37℃温育 2h。结果表明 ,双价核酶和三价核酶均表现出较高的切割活性 ,其中双价核酶处理的切割产物的大小与理论值相符合。三价核酶虽表现出较高的切割活性 ,但只是其中一价核酶在起作用。讨论了二价和三价核酶的应用前景。 相似文献
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抗TGFβ1核酶以及嵌合型核酶的细胞外和肝星状细胞内活性鉴定 总被引:1,自引:0,他引:1
大量研究表明转化生长因子β1参与细胞的多种生理和病理过程. 为了研究TGFβ1在这些过程中的详细发病机制, 设计了针对TGFβ1的非嵌合型锤头状核酶和U1小核RNA嵌合型核酶. 鉴定非嵌合型锤头状核酶和U1小核RNA嵌合型核酶的胞外以及活化型肝星状细胞内的活性. 核酶的胞外切割反应结果证实, 非嵌合型核酶的胞外活性优于U1小核RNA嵌合型核酶. 进一步研究发现, U1小核RNA嵌合型核酶在转染的肝星状细胞内可以高效下调TGFβ1的表达, 且其胞内活性明显强于非嵌合型核酶. 这些结果表明, 抗TGFβ1的U1小核RNA嵌合型核酶不仅为TGFβ1在细胞的生理和病理过程中具体作用机制的研究提供一种有效的工具, 而且有望为TGFβ1相关性疾病的治疗提供一个有效手段. 相似文献
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一个双价锤头型核酶在体外对两种不同植物病毒RNA的专一切割作用 总被引:1,自引:0,他引:1
根据锤头核酶模型,设计合成了一个以黄瓜花叶病毒(CMV)外壳蛋白(CP)亚基因组RNA为底物的锤头型核酶(RZC),在证明它能有效切割该底物后,再将这个核酶与一个能专一性切割烟草花叶病毒(TMV)移动蛋白(MP)亚基因组RNA的锤头型核酶(RZ1)相互串联构成了一个双价核酶(RZ1C),体外结果表明,这个双价核酶能与相应的单价核酶RZ1和RZC一样专一而有效地切割CMV CP和TMV MP RNA 相似文献
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E.coli RNase P复合体的M1RNA亚单位是一类具有催化活性的核酶,它切割tRNA前体分子(pre-tRNA)的5′端前导序列,产生成熟的tRNA分子。M1RNA主要通过结构特异性识别底物,不需要底物有特定的序列,从而可设计修饰过的核酶为抑制靶基因的表达,在消除染色体易位产生的肿瘤相关畸形染色体上,M1RNA是一种理想的工具,研究表明M1RNA作为一种新型核酶有着广阔的应用前景和极大的临床价值。 相似文献