苏北地区规模化猪场产肠毒素大肠杆菌的分离鉴定及灭活疫苗效果评估

[目的]产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是引起仔猪腹泻的重要病原菌,本研究通过调查苏北地区规模化猪场ETEC的流行情况,分析其生物学特性,研制具有免疫保护效果的优势血清型菌株的灭活疫苗,以期对苏北地区ETEC的防控提供参考。[方法]从苏北地区规模化猪场采集3-30日龄的仔猪新鲜粪样、肛拭子及小肠组织样,分离出ETEC,对分离菌株进行血清型鉴定、耐药性测定、小鼠致病力测定;最后通过动物免疫试验研究优势血清型菌株灭活疫苗对小鼠的免疫保护效果。[结果]从21个规模化猪场采集病料562份,通过PCR鉴定及测序得到141株ETEC;血清凝集试验鉴定出85株菌的O抗原血清型,其中08、0101和0128为优势血清型,占定型菌株的61.2%(52/85),其他血清型包括09、03、020、0148、0149等;分析141株ETEC对14种常见抗生素的耐药情况,得出分离株对新霉素、红霉素、四环素、庆大霉素、强力霉素、阿莫西林、甲氧苄啶/磺胺甲恶唑高度耐药,耐药率均高达80%以上;对恩诺沙星敏感性较高,敏感率达50.4%(71/141);对多粘菌素B和头孢噻肟中介耐药,占比分别为66%(93/141)和51.8%(73/141);多重耐药现象严重,其中10重耐药的菌株占比最大,为19%(27/141);小鼠攻毒试验测得08血清型强毒株YC-6的半数致死量(median lethal dose,LD50)为1.4×10^7 CFU/只,最低致死量(minimum lethal dose,MLD)为3×10^7 CFU/只;08血清型强毒株YC-6和0101血清型强毒株LYG-3制备的单价灭活疫苗对小鼠的保护率均达到100%,因此利用08血清型强毒株YC-6和0101血清型强毒株LYG-3研制二价灭活疫苗,结果显示该二价疫苗对感染不同血清型ETEC小鼠的保护率在83%以上。[结论]本研究通过对苏北地区ETEC的流行病学调查,得出其优势血清型,并研制出针对对优势血清型免疫保护效果较好的二价灭活疫苗,给临床ETEC的监测和防控提供参考。     

朱顶红新品种DUS测试数量性状筛选与分级

利用70个朱顶红品种对12个数量性状进行了筛选及分级研究,并对5个数量性状的测量部位进行了研究。结果表明:所有性状均满足DUS测试要求,性状2由于区分能力弱不适于作为DUS测试性状。12个数量性状可进行3~9个连续分布的分级。花茎从下往上逐渐变细,但不同品种变细程度略有差异,在测量花茎中部的最大宽度时要求严格测量花茎的1/2处;不同茎上各数量性状测量值略有差异,除花茎长度和花梗长度外的性状差异不显著;同一花茎不同花间数量性状差异较小;同品种的花外花被片长度、宽度不存在显著差异;种球大小对数量性状有显著影响。     

藤黄生孢链霉菌NRRL 2401遗传操作系统和基因文库的构建北大核心CSCD

【目的】建立藤黄生孢链霉菌NRRL 2401的遗传操作系统和基因文库,以便筛选次级代谢产物生物合成基因。【方法】利用大肠杆菌和链霉菌的属间接合转移的方法,以整合型载体pPM927、pSET152和复制型载体pJTU1278构建链霉菌遗传操作系统。以pCClFOS^(TM)载体,大肠杆菌EP1300^(TM)-T1~R为宿主菌构建Fosmid文库。随后,设计引物,利用"板池-行池-单克隆"的三级PCR方法对文库进行快速筛选。【结果】pPM927、pSET152和pJTU1278均成功转入藤黄生孢链霉菌NRRL 2401,其中pSET152载体的转化效率最高。构建了稳定高效的藤黄生孢链霉菌NRRL 2401的基因文库,含2880个克隆,平均插入片段大小约为35 kb,空载率小于1%,文库覆盖率为99.99%,覆盖基因组16.5倍。同时,初步筛选出可能含有吲哚霉素生物合成基因簇的9个阳性克隆。【结论】成功构建了稳定高效的藤黄生孢链霉菌NRRL 2401遗传操作系统和高质量的基因文库,为克隆该菌中次级代谢产物生物合成基因簇以及进一步遗传改造奠定了基础。     

靶向铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)粘肽合成酶PBP3的抗菌先导化合物的虚拟筛选及活性研究

【目的】开发出与铜绿假单胞菌粘肽合成酶PBP3有高亲和力,具有全新结构的先导化合物。【方法】以铜绿假单胞菌粘肽合成酶PBP3为靶点,通过分子对接软件DOCK6.5,对含有104万个小分子化合物的数据库进行了大规模虚拟筛选,选取结构相对简单的中选化合物进行合成,得到先导化合物,并验证其抑菌活性。【结果】通过grid score进行第一轮初筛,筛选出grid score分值小于–30 kcal/mol的6万个化合物,接着以amber score进行第二轮筛选,筛出amber score分值小于–20 kcal/mol的化合物约200个。最终,经过观察分析,从中挑选出4种打分高并且结构新颖的小分子化合物作为先导化合物。合成出的先导化合物及其衍生物对铜绿假单胞菌等常见微生物的最小抑菌浓度(MIC)在175–275μg/m L之间,对革兰氏阴性菌和阳性菌均有效,MIC值比作为阳性对照的磺胺嘧啶更低,说明先导化合物具有较好的抗菌活性。【结论】这些先导化合物可以进一步开发为新型抗菌药物,用于解决铜绿假单胞菌的耐药性问题。     

牛源无乳链球菌长尾噬菌体的特性

【目的】分离鉴定噬菌体,对其生物学特性进行研究,并筛选候选毒株为防控牛源无乳链球菌的感染提供依据。【方法】分别采用从牛奶或环境中分离、溶原菌诱导两种方法分离鉴定无乳链球菌噬菌体,利用双层琼脂平板法纯化。将新分离鉴定毒株与前期已分离鉴定的源自乳腺炎牛奶的无乳链球菌噬菌体JX01进行分析和比较,包括噬菌体透射电镜形态观察、对55株无乳链球菌和其他细菌的宿主谱鉴定、噬菌体基因Eco R I、Sal I、Xba I或Pst I的酶切图谱、最适MOI、吸附曲线和一步生长曲线、不同保存条件下的稳定性等。【结果】分离鉴定的3株噬菌体LYGO9、HZ04和p A11(诱导自牛源菌株HAJL2011070601)与JX01比对分析,结果显示,4株噬菌体均为长尾噬菌体;Eco R I、Sal I、Xba I、Pst I的酶切图谱分获4、3、3或2种带型,显示4株噬菌体为不同毒株;均特异性裂解牛源无乳链球菌,对42株牛源无乳链球菌的裂解率如下:LYGO9为28.6%(12/42)、p A11为31%(13/42)、HZ04为47.6%(20/42)、JX01为54.8%(23/42);同时,LYGO9与p A11、HZ04和JX01分别有共同宿主11、12和11株;HZ04与JX01有共同宿主18株,提示它们具有同源性。LYGO9感染宿主的潜伏期短,仅5 min,平均裂解量为30。分离株在SM液中4°C至少可保存1个月。【结论】分离鉴定的3株牛源无乳链球菌噬菌体均为长尾噬菌体,其中LYGO9潜伏期短、裂解量较大。     

西藏土壤中耐辐射阿氏芽胞杆菌T61的分离和鉴定

【目的】对分离自西藏土样的菌株T61进行分离、鉴定和UV辐射抗性分析。【方法】对菌株T61进行形态和生理生化鉴定;对16S r RNA基因进行克隆和测序,构建系统进化树;测定脂肪酸成分和GC含量,将T61与最相近种进行DNA-DNA杂交;测定T61的UV辐射抗性曲线。【结果】T61细胞杆状,长度约为2μm,直径约为1μm,革兰氏阳性,可产生内生孢子。G+C含量为38.02%。脂肪酸主要成分是C14:0 iso、C15:0 iso和C15:0 anteiso。16S r RNA基因与阿氏芽胞杆菌B8W22T和巨大芽胞杆菌IAM13418T相似度最高,分别达到99.93%和99.53%。DNA-DNA杂交分析表明,T61与阿氏芽胞杆菌B8W22T的相似度为81.4%,而与巨大芽胞杆菌IAM13418T的相似度只有50.3%。UV辐射抗性分析显示,T61 D10为100 J/m2,远高于辐射敏感的大肠杆菌K12和枯草芽孢杆菌等菌株。【结论】菌株T61是一株阿氏芽胞杆菌,命名为Bacillus aryabhattai T61,其对UV辐射具有较强的抗性。     

水稻粒簇生材料Cgr320的鉴定及遗传偏分离分析

籽粒簇生稻Cgr320为一类水稻突变材料,其性状表现为2~3朵颖花(籽粒)簇生在水稻主穗轴或枝梗顶部。为了进一步明确其簇生性状的遗传机制,本研究用Cgr320作父本分别与武运粳24和93-11配制了2个杂交组合,获得杂种F1、F2分离群体,对亲本、F1和F2群体的簇生性状进行了形态学观察和遗传连锁分析。结果表明,Cgr320其他农艺性状与普通栽培稻差异不显著。簇生性状在F1植株表现为野生型,在F2群体中出现严重偏离孟德尔(3∶1)遗传分离,卡方测验值X2(3∶1)为7.71和144.87。随机选取第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12染色体上RM493、RM3762、RM1338、RM3217、RM249、RM20155、RM3325、RM22418、RM6797、RM1146、RM7557和RM27706等12对微卫星标记对武运粳24/Cgr320 22个F2隐性(簇生)单株进行遗传连锁分析,发现12个标记所扩增的22个F2隐性单株基因型都极显著偏向武运粳24,卡方检验值X2(1∶2∶1)大于X2(0.05,2)临界值5.991,控制cgr320簇生性状基因存在严重偏分离遗传,这种遗传现象必将误导我们判定控制籽粒簇生基因所在的连锁群。本研究结果将为水稻基因定位研究提供参考信息。     

高产莫纳可林K低产桔霉素红曲霉菌株的筛选和发酵条件初步优化

采集全国各地红曲霉制品中的红曲霉资源,经分离获278株红曲霉菌株。高效液相色谱(HPLC)法测定各菌株发酵液中莫纳可林K(Monacolin K)和桔霉素含量,筛选获1株Monacolin K产量较高、桔霉素含量较低的红曲霉菌株编号为M-22。依据形态特征和ITS基因序列,参照红曲霉属分类检索表,鉴定M-22菌株为紫色红曲霉(Monascus purpureus)。通过摇瓶发酵对温度、初始pH、碳源、氮源、碳氮比(C/N)等因素进行优化,确定M-22菌株摇瓶发酵产Monacolin K适宜条件为发酵温度26℃、初始pH 5.0、转速160 r/min,甘油为碳源、蛋白胨为氮源、碳氮比(C/N)为5:1,Monacolin K产量显著提高,最高为107.16 mg/L。以优化的发酵条件对M-22菌株进行5 L发酵罐发酵,发酵液中Monacolin K产量最高为189.83 mg/L,桔霉素含量32.53μg/L,红曲色素色价为16.38 U/m L。     

光合细菌的分离、保存及其同化磷能力试验研究

为了研究光合细菌的保藏方法及其同化磷能力,采用液体种室内自然放置、液体种蜡封和穿刺物蜡封等方法对光合细菌进行保藏方法研究,结果表明,液体种蜡封和穿刺物蜡封可作为该菌种的长期保存方法;对两株菌的磷同化能力进行了比较,降解率分别为22%和15%。本研究为获得光合细菌的长期保存方法及其在污水净化中的应用提供参考。     

类芒齿黄芪地下部分化学成分研究

为了解类芒齿黄芪( Astragalus camptodontoides)主要化学成分,从其地下部分甲醇提取物的乙酸乙酯部位分离出19个单体化合物,通过现代波谱分析及理化性质等手段分别鉴定为异补骨脂黄酮(1),4′-hydroxy-isolonchocarpin (2),5-去氧山豆根黄酮(3),shinflavanone (4),khonklonginols H (5),4′-O-methylpreglabridin (6),3′-hydroxy-4′-O-methylglabridin (7),4′-O-methylglabridin (8),8-prenyl-phaseollinisoflavan (9),xambioona (10),光甘草酚(11),粗毛甘草素H (12),methylnissolin (13),邻苯二甲酸异丁酯(14),邻苯二甲酸丁酯异丁酯(15),β-谷甾醇(16),胡萝卜苷(17),齐墩果酸(18),(2S,3S,4R,9E)-1,3,4-trihydroxy-2-[(2′R)-2′- hydr-oxytetraco-sanoylamino]-9-octadecene (19)。化合物1~19均为首次从该植物中获得,化合物1~7为首次从黄芪属(Astraga-lus)植物中分离得到。