HIV-1整合酶链转移反应抑制剂的荧光筛选方法

整合酶被认为是抗HIV-1药物研究的理想靶点之一。为了建立便捷高效的整合酶链转移反应抑制剂筛选方法,首先将HIV-1整合酶原核表达载体pNL-IN转化入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)进行原核表达,并用镍琼脂糖凝胶进行亲和纯化,获得了纯度和活性均较高的整合酶重组蛋白;然后设计了生物素标记的供体DNA和FITC标记的靶DNA,用链霉亲和素磁珠捕获反应体系中的DNA产物;最后用荧光分析仪检测DNA产物的荧光信号,并计算待测样品的抑制率。用已知整合酶抑制剂S-1360和MK-0518对筛选方法进行了验证,测定结果与已有实验数据相当,表明本筛选方法能够有效应用于HIV-1整合酶链转移反应抑制剂的筛选。与现有的整合酶链转移反应抑制剂筛选方法相比,本筛选方法步骤更为简化、耗时更短、成本更低。     

紫花苜蓿多元杂交后代优良株系筛选研究

通过对甘农3号、甘农5号和游客紫花苜蓿多元杂交后代选育的36个株系及其亲本的生长、产量、品质等相关指标的测定,采用灰色关联度理论,构造综合评价模型进行供试材料综合评价,筛选出速生12#、速生11#株系为最理想的优良株系,生长高度分别为105.44cm、105.42cm;生长速度分别为1.74cm/d、1.68cm/d;茎叶比分别为0.30、0.35;分枝数分别为23、17;鲜草产量分别为39.99 t/hm2、35.13 t/hm2;粗蛋白含量分别为19.95%、23.89%;相对饲用价值为153.15%、157.02%。多叶2#、速生5#、速生20#、速生21#等4个株系为较理想的优良株系。     

高粱耐盐性评价方法研究及耐盐碱资源的筛选

用5.500 g/L盐水溶液对3～5叶期高粱幼苗进行处理,用幼苗相对成活率对568份高粱种质进行分级,结果显示:5%的种质具有3级以上的耐盐性。此法可以用来进行大量种质的苗期耐盐筛选。根据植株在不同含盐量的盐碱地上生长的性状差异,对成株期的高粱进行耐盐鉴定,利用处理间性状的差异及各性状与穗重和秆重的相关性构建一个耐盐指数来评价材料对盐碱的耐性,从而对18个高粱品种和品系进行了分级,以适合于盐碱地推广品种的筛选。     

发酵法制备富马酸的关键技术及其进展

随着人们对食品领域安全的关注以及石油基富马酸价格的不断攀升,利用可再生生物质原料发酵法制备富马酸备受关注。探讨了发酵法制备富马酸的关键技术问题,从菌种改造、淀粉基原料发酵、纤维质原料发酵以及非钙盐中和等工艺角度阐述了富马酸工业化生产的技术和经济可行性。     

土壤中高产蛋白酶菌株产酶条件及酶学性质

【背景】微生物蛋白酶已经成为工业用蛋白酶的主要来源,筛选具有特殊环境适应性的微生物成为生物酶资源的开发热点。【目的】通过对青藏高原土壤微生物产蛋白酶菌株的筛选、优化及相关特性研究,寻找新的蛋白酶资源,为高原菌种资源利用提供科学依据。【方法】采用形态学和分子生物学对筛选菌株进行菌种鉴定,利用单因素试验和正交试验对菌株进行发酵条件优化及酶学性质的探究。【结果】筛选出一株高产蛋白酶菌株XC2,经鉴定菌株XC2为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。XC2最优产酶条件:可溶性淀粉4.0%,牛肉膏1.0%,K~+0.6%,培养温度34°C、初始pH 7.0、接种量2.0%的条件下200 r/min振荡培养13 h,所产蛋白酶活力最高为638.5 U/mL。XC2所产蛋白酶最适反应温度60°C,最适pH9.0;40-50°C、pH8.0-10.0条件下酶活稳定性较高;Mn~(2+)对酶活力有明显激活作用,而Zn~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(2+)、Fe3+对酶活力有明显抑制作用。【结论】枯草芽孢杆菌XC2有较强的产碱性蛋白酶的能力,具有较好的应用前景。     

地毯草黄单胞菌双组分系统VgrS-VgrR基因敲除及表型筛选

【目的】研究地毯草黄单胞菌双组分系统VgrS-VgrR与致病性的关系,为木薯细菌性病害的高效防控提供分子生物学证据。【方法】采用同源重组方法构建vgrS和vgrR的插入失活突变体,用可移动的cosmid载体p HM1构建互补菌株。检测突变体的致病性、细菌游动性、胞外酶、胞外多糖的变化,观察细菌对H_2O_2和金属离子胁迫的反应。【结果】相比野生型菌株,vgrS和vgrR突变体接种寄主植物木薯后致病力显著降低,突变体的游动性减少、蛋白酶活性减弱、H_2O_2耐受性降低,在高浓度金属离子Fe²⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Co²⁺的胁迫条件下菌体生长显著减弱。然而,vgrS和vgrR突变体的胞外多糖含量显著升高,分别是野生型的2.14和1.89倍。【结论】阐明了VgrS-VgrR系统在细菌致病过程中发挥的重要作用,为鉴定VgrS-VgrR调控机制提供线索,为药物筛选提供靶向目标。     

一株脱卤单胞菌属有机卤呼吸细菌的分离纯化与基础特征

【目的】分离鉴定新型有机卤呼吸细菌,拓展有机氯污染物降解菌种资源。【方法】在限制性培养基中,基于特定脱卤微生物的能量代谢特点以及对抗生素的抗性特征,应用绝迹稀释法从脱氯富集培养物中分离纯化新型有机卤呼吸细菌。通过添加酵母提取物和聚合酶链反应-限制性片段长度多态性等方法鉴定菌株纯度。通过考察细胞形态、16S rRNA系统发育树以及对有机氯化物的利用能力来描述此新型菌株的基本特征。【结果】菌株GP是一株来自脱卤单胞菌属(Dehalo genimonas)的新型有机卤呼吸细菌,可耐受1.0 g/L的氨苄青霉素和0.1 g/L的万古霉素,其细胞平面形态为直径0.4–0.8μm的不规则圆形。在乙酸作碳源、氢气作电子供体的条件下,菌株GP可利用1,1-二氯乙烯和一氯乙烯作为电子受体进行有机卤呼吸,脱氯终产物为无毒害的乙烯。16SrRNA系统发育分析表明,菌株GP与Dehalo genimonas formicexedens菌株NSZ-14有高达99.5%的同源性,但两菌株对有机氯化物底物的利用范围不同。【结论】从脱氯富集培养物中分离纯化出一株新型有机卤呼吸细菌,为深入研究脱卤单胞菌这一重要脱卤微生物的遗传学信息和生理生化性质提供了新材料。     

ELP[Ⅰ]50标签在重组硫氧还蛋白分离纯化中的应用及PEG对其相变温度的影响

[目的]使用自行设计的类弹性蛋白(Elastin-like protein,ELP) ELP[Ⅰ]50作为非色谱纯化标签,分离纯化重组硫氧还蛋白(Thioredoxin,Trx),并研究聚乙二醇(Polyethyleneglycol,PEG)对ELP[Ⅰ]50-Trx相变温度(Inverse temperature transition,Tt)的影响.[方法]人工合成Trx基因,将其亚克隆到自行构建的表达载体pET28编码ELP[Ⅰ]50标签下游,转入大肠杆菌BLR(DE3)进行表达.融合蛋白表达后,采用可逆相变循环(Inverse transition cycling,ITC)分离纯化,并检测不同浓度PEG时的Tt值.[结果]成功表达、分离纯化出融合蛋白ELP[Ⅰ]50-Trx,检测出该蛋白浓度为25 μmol/L时,Tt为28.6℃;而当PEG的浓度为5％、10％、15％、20％时,Tt分别降至22.3℃、15.9℃、6℃、0℃.[结论]ELP[Ⅰ]50标签高效纯化重组蛋白具有操作简便、成本较低、易于扩大的优势,而PEG能降低蛋白的Tt值,进一步增强分离纯化效果,扩大使用范围,可望应用于分离纯化多种重组蛋白.     

对叶榕榕果内生细菌分离鉴定及抑菌活性的研究

【目的】为植物-内生细菌的生态关系研究, 以及植物内生细菌资源的利用提供一定的依据。【方法】采用微生物学传统分离培养的方法从对叶榕果实中分离到内生细菌54株, 通过限制性酶切分析(ARDRA)共有16个操作分类单元(Operational taxonomic units, OTUs), 对16株代表菌株16S rDNA序列系统发育分析。【结果】16个菌株都找到了与其相似性最高的菌株, 相似性达到95%?100%。其中6株为芽孢杆菌Bacillus属, 为对叶榕果实内生细菌优势菌属; 3株为Staphylococcus属, 2株为Pseudomonas属, 1株为Serrata属, 1株为非培养细菌的同源菌, 1株为Kocuria属, 1株为Delftia属, 还有1株为Acinetobacter属。【结论】这16株内生菌在系统发育树中明显聚为两大支; 在参与抑菌试验的14株内生菌中, 有13株对受试菌有不同程度的拮抗作用。尤其是其中的芽孢菌属的Swx15和不动杆菌属的Swx25菌株, 抑菌作用较强, 且有较广的抑菌谱性。     

一株高效去除亚硝酸氮细菌的分离鉴定及其脱氮特性研究

【目的】从南美白对虾养殖塘中分离到高效去除亚硝酸氮的细菌, 对其分类和脱氮特性进行了研究。【方法】 以除亚硝酸氮为主要指标, 取养殖塘底层水样分离筛选菌株; 依据16S rRNA基因序列和生理生化特征初步鉴定菌株; 研究不同碳源、碳氮比、起始pH、温度、摇床转速和氯化钠浓度对反硝化除亚硝酸氮的影响, 并考查了菌株对硝酸氮和氨氮的利用情况。【结果】得到的菌株中菌株FP6活性最高, 初步鉴定菌株FP6属于地衣芽孢杆菌。菌株FP6的生长最适脱氮碳源为蔗糖, 菌株FP6去除亚硝酸氮有高活性的条件范围为: C/N值15?25、起始pH 7.0?10.0、温度20 °C?37 °C、摇床转速0?200 r/min和氯化钠浓度0?40 g/L。菌株FP6对硝酸氮和氨氮都有一定的去除能力, 利用硝酸氮时不积累亚硝酸氮。【结论】地衣芽孢杆菌FP6具有优良的除亚硝氮特性, 适宜的温度、pH和盐度范围较宽。