嗜酸氧化亚铁硫杆菌基因组分泌蛋白的初步分析

利用信号肽预测软件SignalP v3.0、跨膜螺旋结构预测软件TMHMM v2.0和非经典分泌蛋白预测软件SecretomeP对嗜酸氧化亚铁硫杆菌全基因组的3 218个氨基酸序列进行预测分析.结果表明在嗜酸氧化亚铁硫杆菌中有507个蛋白为分泌蛋白,其中分泌型信号肽120个(其中有9个为RR-motif亚组型信号肽),脂蛋白信号肽3个,Prepilin-like信号肽4个,非经典分泌蛋白380个.并对分泌型信号肽的长度分布、氨基酸使用频率和酶切位点的氨基酸使用频率作了统计.得分最高的100个非经典分泌蛋白中,有36个具有功能分类,主要是参与细胞壁、能量代谢及转运和结合的蛋白质.嗜酸氧化亚铁硫杆菌的这507个分泌蛋白所参与的生化过程可能发生在膜外的周质空间或是菌体外的场所,为该物种与矿物相互作用,以及对环境做出响应服务.     

Ad-sTNFRI-IgGFc腺病毒载体的构建及其转染人气道平滑肌细胞

TNF-a是一种具有广泛生物学活性的前炎症细胞因子, 参与哮喘整个病理生理过程。可溶性肿瘤坏死因子受体(sTNFR)可以拮抗肿瘤坏死因子活性, 已被用来治疗与TNF相关的炎性疾病。将sTNFRI-IgGFc基因插入腺病毒穿梭质粒pDC316, 与辅助质粒pBHGloxΔE1, 3Cre共转染HEK293细胞, 重组产生Ad-sTNFRI-IgGFc, PCR鉴定毒种正确后, 进行扩增、纯化和滴度测定, 转染人气道平滑肌细胞, 利用RT-PCR、免疫组化方法, 流式细胞仪, ELISA检测转染后细胞中sTNFRI-IgGFc的转录和表达。实验结果证明成功构建了Ad-sTNFRI-IgGFc腺病毒载体, 感染性滴度达3×1010 TCID50/mL, 200 moi转染气道平滑肌细胞阳性率达99.32%, 转染后气道平滑肌细胞在mRNA和蛋白水平均有sTNFRI-IgGFc表达。转染上清稀释64倍后仍对TNF有拮抗活性。为将表达sTNFRI-IgGFc腺病毒基因治疗哮喘的实验研究提供了基础。     

人源性抗HBsAg抗体Fab段在酵母中的表达

通过分步整合的方式,将人源性抗乙肝表面抗原（HBsAg）抗体Fab的轻、重链基因分步整合到巴斯德毕赤（Pichia pastoris）酵母GS115菌株的染色体上,经甲醇诱导,成功地分泌表达出抗HBsAg抗体的Fab片段,表达量达50～80mg/L。ELISA结果显示重组酵母分泌表达出的Fab具有较强的结合HBsAg的能力。通过抗Fab的抗体柱亲和层析,纯化出了纯度较高的Fab产品。     

主要病原念珠菌蛋白酶分泌水平的比较

目的了解不同病原念珠菌蛋白酶分泌情况,探讨蛋白酶活性与菌种致病力的关系.方法 采用牛血清白蛋白(BSA)琼脂平板检测7种(共286株)念珠菌酸性蛋白酶的分泌;将菌株分别经摇瓶液体培养测定胞外蛋白水解活力.结果7种念珠菌蛋白酶分泌水平的高低关系为白色念珠菌＞热带念珠菌＞近平滑念珠菌＞季也蒙念珠菌＞其他3种念珠菌,与菌种致病力强弱关系基本一致;白色念珠菌、热带念珠菌菌株平均产酶能力是光滑念珠菌、乳淋念珠菌的17.4～36.3倍.各种念珠菌产生的蛋白酶均属天冬氨酸蛋白酶类.结论蛋白酶与念珠菌致病性关系密切.     

血小板活化因子对大鼠黄体细胞孕酮分泌及血管内皮生长因子表达的作用

本文旨在研究血小板活化因子(platelet-activating factor,PAF)对大鼠黄体细胞孕酮分泌及血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)mRNA表达的作用.将未成年(25～28 d)Sprague-Dawley雌性大鼠颈部皮下注射50 IU孕马血清促性腺激素(pregnant mare serum gonadotrophin,PMSG),48 h后注射25 IU人绒毛膜促性腺激素(human chorionicgonadotrophin.hCG)诱导卵泡发育和黄体生成,第6天(hCG注射日为第1天)收集卵巢黄体细胞,体外培养24 h后,不加或加入不同剂量(0.1 μg/mL、1 μg/mL、10 μg/mL)PAF,37℃、5%CO2培养箱内培养24 h.用放射免疫方法测定培养液中孕酮的含量,流式细胞仪和RT-PCR方法检测黄体细胞凋亡以及VEGF mRNA的表达.结果显示,PAF促进黄体细胞孕酮分泌,1 μg/mL PAF作用最强(P<0.05);PAF促进黄体细胞凋亡无明显剂量依赖性,但10 μg/mL PAF显著促进大鼠黄体细胞凋亡(P<0.05):PAF刺激黄体细胞VEGF mRNA表达,1 μg/mL PAF效果最显著(P<0.01).结果提示,PAF可通过调节黄体细胞孕酮的分泌和VEGF mRNA的表达来促进黄体形成.     

转基因番木瓜作为抗结核植物口服疫苗的初步研究

转基因植物疫苗的研制,可改变传统的疫苗接种方式和接种手段,大大降低疫苗的生产成本,具有广阔的应用前景。结核病的泛滥使抗结核的免疫预防急需开发新型的疫苗,研制抗结核的转基因植物疫苗具有重大的理论和实践意义。本文对具有良好免疫原性的结核杆菌分泌蛋白ESAT—6基因,进行了修饰改造,构建了带潮霉素选择抗性基因的植物表达载体和根癌农杆菌工程菌;采用叶盘法转化热带水果番木瓜,获得了13株抗性植株,通过PCR、Southern blot和RNA dot blot分子检测,确认了4株为转基因植株。番木瓜ESAT—6转基因植株的获得,为进一步的结核病植物口服疫苗的免疫研究和新型抗结核疫苗的研制与开发奠定了基础。     

利用短短小芽孢杆菌启动子和信号肽编码序列构建穿梭分泌表达载体

以短短小芽孢杆菌B15的总DNA为模板,利用PCR技术克隆到其细胞壁蛋白基因串联启动子和信号肽编码序列,测序分析后提交GenBank,登录号为AY956423。重新设计引物扩增该片段并在PCR产物两侧引入BamHⅠ和PstⅠ酶切位点,将PCR产物双酶切后克隆至穿梭载体pP43NMK的相应位点构建分泌表达载体pP15MK,插入片段置于该载体中mpd基因的上游,并使信号肽编码序列与去除了自身信号肽编码序列的mpd基因阅读框恰好融合。将pP15MK导入枯草杆菌构建表达菌株1A751(pP15MK),在短短小芽孢杆菌启动子和信号肽元件的带动下,mpd基因能够在表达菌株的对数生长期和稳定期持续性高效分泌表达,表达产物结合在细胞膜上;发酵液在48h酶活达到最高值7.79U/mL,是出发菌株邻单胞菌M6表达量的8.1倍。     

非粒细胞缺乏患者侵袭性气道曲霉病19例临床分析

目的提高对非粒细胞缺乏患者侵袭性气道曲霉病的认识及诊疗水平。方法回顾性分析19例非粒细胞缺乏患者侵袭性气道曲霉病的危险因素,临床特征,影像学,支气管镜下表现,治疗及预后资料。结果 19例患者男性13例(68%),女性6例(32%),年龄33~76岁、平均(57.32±11.69)岁。既往患慢性阻塞性肺疾病4例(21%),糖尿病4例(21%),肺癌3例(16%),高血压病3例(16%),陈旧性肺结核病2例(11%),支气管扩张2例(11%),肺血管炎1例(5%),间质性肺病1例(5%);其中2例患者有3种以上基础疾病,7例有2种基础疾病。常见的临床症状为咳嗽,气急(100%),发热(74%);影像学改变早期主要为沿气道分布的结节,渗出,12例患者入院后胸部CT显示病灶明显进展;支气管镜下改变以混合型为主;首选治疗药物为伏立康唑针;总疗程均大于6周,最长22周;死亡率为16%,其中1例因经济原因治疗4周后自行停药,8周后再次因为肺部出现新病灶病情进展再次入院。结论侵袭性气道曲霉病是侵袭性肺曲霉病的一种少见类型,在非粒细胞缺乏的患者身上常常漏诊、误诊,提高对本病的认识,及早进行支气管镜检查,早期诊断及全身治疗可以减少患者的死亡率。     

猪圆环病毒Ⅱ型ORF2基因在酵母中的高效分泌表达

为了建立一种简便的检测猪圆环病毒2型(PCV2)的方法,本实验将PCV2的ORF2基因片段整合到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株X-33染色体上,构建了X-33(pPICZa-ORF2)重组工程菌.经甲醇诱导后,成功的表达出ORF2基因片段.经过Bradford 蛋白质总含量测定和凝胶薄层扫描结果表明,表达产物占重组工程菌培养上清总蛋白的58%,表达量可达47mg/ L.间接ELISA结果初步表明重组表达产物具有良好的抗原性,能够有效地区分PCV2型病毒标准阳性与阴性血清.     

野油菜黄单胞菌分泌组双向电泳样品制备方法的建立

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonas campestris pv.campestris,Xcc)是十字花科植物黑腐病的病原细菌。我们建立了Xcc的蛋白质组学研究平台,用于分离、鉴定该菌的致病相关蛋白。为了减少胞外多糖(exopolysaccharide,EPS)对蛋白材料质量的影响,我们构建了EPS缺陷的Xcc8004ΔgumB突变体。本研究以Xcc8004ΔgumB出发菌株,用诱导培养液培养,取细胞上清通过超滤浓缩得到蛋白质粗提物,分别采用丙酮沉淀法、试剂盒纯化法和丙酮沉淀-试剂盒联用法来纯化蛋白质粗提物,通过比较双向电泳的结果优选最佳的样品制备方法。结果证明丙酮沉淀-试剂盒联用法较为理想,所得双向电泳图片清晰,分辨率高。因此,此方法可以用于制备野油菜黄单胞菌分泌组双向电泳样品,并可以满足进一步研究的需要。