凝集素芯片技术检测糖蛋白方法的建立及初步应用

建立了凝集素芯片技术检测糖蛋白的方法,对实验条件进行了优化,应用凝集素芯片初步检测分析了Chang?蒺s liver正常肝细胞总蛋白中的糖蛋白糖链构成．将凝集素ConA、GNA固定于环氧化修饰的玻片表面,用Cy3标记标准糖蛋白RNaseB,利用凝集素识别特异糖链的原理建立凝集素芯片检测糖蛋白的方法．摸索出最佳封闭剂是含1% BSA的磷酸缓冲液,最佳孵育时间及温度为3 h和室温,最佳孵育缓冲液为含1% BSA和0.05% Tween-20的磷酸缓冲液,并用甘露糖抑制实验验证了凝集素芯片结合的特异性．用包含10种凝集素的芯片,成功解析了标准糖蛋白RNaseB、Fetuin的糖链构成,证实了凝集素芯片检测糖蛋白糖链的可行性．最后用凝集素芯片初步检测分析了Chang?蒺s liver正常肝细胞总蛋白中的糖蛋白糖链构成,发现 Chang's liver正常肝细胞总蛋白中的糖蛋白可能有多价 Sia或GlcNAc、terminalα-1,3 mannose、GalNAc、Galβ-1,4GlcNAc这些糖链结构的存在．蛋白质糖基化是一种重要的翻译后修饰,它在微生物感染、细胞分化、肿瘤转移、细胞癌变等生命活动中起着重要作用,因此近年来蛋白质的糖基化研究受到广泛的重视,但由于缺乏一种简便、快速、高通量的检测手段,蛋白质糖基化修饰的研究发展缓慢．凝集素芯片技术的出现实现了对糖蛋白的快速、准确、高通量的检测 分析．     

白桦茸凝集素提取工艺的优化

对白桦茸凝集素最佳提取工艺进行了研究.以2%兔血细胞凝血效价为指标,确定了最佳提取缓冲液.通过正交试验对料液比、提取时间、提取液pH值、NaCl浓度等因素进行了优化分析并确定了提取工艺的最佳参数组合.结果表明,以TBS和PBS为提取缓冲液所得的白桦茸凝集素凝集效价分别为64、16;最佳提取工艺:液料比为50:1,提取时间为20h,NaCl浓度为0mol/L,缓冲液pH值为8.0,按该最佳工艺提取白桦茸凝集素凝血效价为256.所优化的提取工艺稳定、可行,为该凝集素进一步在免疫调节方面的开发应用提供一定基础.     

短额负蝗精子发生过程中SBA受体的动态分布

用常规组织学方法观察短额负蝗Atractomorpha sinensis Bolivar精子发生过程中生精细胞的显微结构,并以大豆凝集素(soybean agglutinin,SBA)为探针利用凝集素细胞化学方法研究该过程中N-乙酰半乳糖复合物的分布变化。结果表明,短额负蝗精子发生经历了精原细胞增殖期、初级精母细胞期、次级精母细胞期、精子细胞形成期和精子成熟期5个时期,在这5个时期中各期生精细胞的大小、形态、核染色体等变化明显。在整个精子发生过程中,N-乙酰半乳糖复合物出现于精原细胞期,并于精母细胞期发生明显的修饰和变化,精子形成期和成熟期没有N-乙酰半乳糖复合物的表达。提示,N-乙酰半乳糖复合物的修饰和变化与短额负蝗生精细胞的生长和分化密切相关。     

刺参病害现状及其生物技术检测的研究进展

随着人工养殖规模的扩大,刺参养殖的病害问题已严重阻碍刺参养殖业的发展,如刺参腐皮综合症、化板病、病毒性疾病等.综述了近年来刺参的养殖工艺和模式,以及常见疾病的症状和防治手段.并针对刺参防御系统的特点,从免疫学和分子生物学方面做了相应的探讨和展望.     

一株产凝集素的三叶半夏内生真菌的研究

研究三叶半夏内生真菌及其凝集素,旨在为半夏内生真菌及其凝集素的开发利用提供依据。对三叶半夏块茎内生真菌分离、纯化,液体发酵培养代谢产物,无水乙醇提取总蛋白,兔血红细胞检测其凝集活性,筛选出菌株gs1,其总蛋白对兔血红细胞凝集活性显著。使用甘露聚糖-Sepharose 4B亲和层析柱纯化菌株gs1总蛋白,得到凝集素。Brandford法定量检测分析表明,1000 ml gs1发酵培养液中含有9.58 mg 凝集素。SDS-PAGE 电泳分析显示该凝集素为单一条带,分子量约为12 kDa。凝集活性实验表明,该凝集素对兔、大鼠和小鼠的血红细胞具有凝集作用,对兔血红细胞效果最显著;而对人（A＼B＼O＼AB型）和鸡的血红细胞无凝集作用。糖结合活性实验表明,甘露糖对该凝集素的凝集活性具有抑制作用。通过初步分类鉴定,菌株gs1为半知菌亚门,丝孢纲,丛梗孢目,丛梗孢科,曲霉属。     

三种菜豆凝集素的分离纯化及其与黑皮扁豆凝集素抗血清的免疫交叉反应

利用Tris-HCl缓冲液浸提、硫酸铵分级沉淀、离子交换和分子筛层析,分别从白花菜豆(Phaseolus albiflora L.var)、紫花菜豆(Phaseolus purpurea L.var)、红花菜豆(Phaseolus coccineus L.var)种子中纯化得到3种菜豆凝集素(PAL,白花菜豆凝集素;PPL,紫花菜豆凝集素;PCL,红花菜豆凝集素).纯化的3种菜豆凝集素经SDS-PAGE电泳检测都只有一个分子量约为32 kD的亚基,它们都能与黑皮扁豆凝集素抗血清发生免疫交叉反应.     

重组人半乳凝集素-1的原核表达、纯化及生物活性检测

目的:在大肠杆菌中表达半乳凝集素-1(galectin-1),并进行纯化及生物活性检测。方法:将人半乳凝集素-1基因克隆至带有His融合标签的原核表达载体pQE-30上,转化大肠杆菌M15,经IPTG诱导表达,表达产物经亲和层析纯化后,进行Western印迹鉴定,并用红细胞凝集试验检测其生物学活性。结果:双酶切鉴定和核苷酸序列测定表明重组表达质粒pQE-30-Galectin-1构建正确;重组蛋白的表达量约占菌体总蛋白的50%,主要以可溶形式表达,纯化后蛋白纯度达95%以上,且具有良好的红细胞凝集活性。结论:在大肠杆菌中表达了重组人半乳凝集素-1,且具有良好的生物活性。     

香螺血清、肌肉和唾液腺凝集素凝集性能的初步研究

研究香螺(Naptunea cumingi crosse)肌肉、血清和唾液腺凝集素对7 种脊椎动物红细胞、人的4 种红细胞、4 种单细胞藻类和11 种微生物细胞的凝集性能,同时进行pH敏感性、热稳定性、糖抑制性、EDTA、金属离子以及盐浓度影响试验.结果表明,3 种凝集素对各种细胞的凝集效应存在差异,以家兔红细胞的凝集效果最佳.肌肉和血清凝集素在pH<7.0时均失活,唾液腺凝集素的热稳定性最强,温度为90 ℃仍具有活性.此外,不同的糖溶液对3 种凝集素凝集效果的影响不同,在EDTA浓度为2.00～0.25 mmol/L范围内,3 种凝集素的凝集效价均受到不同程度的抑制.在金属离子影响试验中发现,Zn2+能明显提高肌肉和血清凝集素的凝集活力,而对唾液腺凝集素有抑制的作用.当盐浓度为12～18 g/L时,可增加香螺肌肉凝集素的凝集效价,而当浓度为24～60 g/L时却会抑制肌肉凝集素的凝集活性.     

骆驼蓬种子凝集素粗品活性的初步研究

采用硫酸铵分级沉淀法提取骆驼蓬种子凝集素粗品,并进行凝血活性和抗菌活性检测.凝血实验结果表明:(1)50%～60%硫酸铵饱和度下提取骆驼蓬种子的凝集素粗品对鸡红细胞的凝集活力最强,最低凝集浓度为0.6 mg/L,且其凝集素粗品的活力受温度、pH值、金属离子及糖溶液的影响.(2)不同硫酸铵饱和度沉淀获得的凝集素粗品对6种人体致病细菌及5种能引起水果腐烂和粮食霉变的真菌均有不同程度的抑制作用,其中50%～60%硫酸铵饱和度下提取的凝集素粗品抑菌活性最强,其浓度为1.071 mg/mL时对鲍曼不动杆菌和意大利青霉菌的抑菌环半径分别可达8.1 mm和4.9 mm.     

海芋凝集素cDNA的分子克隆及其性质预测

用cDNA末端快速扩增-聚合酶链式反应（RACE-PCR）方法克隆了海芋（Alocasia macrorrhiza）凝集素的全长cDNA（GenBank检索号DQ340864）,并用多种生物信息学工具对其性质进行了预测。根据来源于天南星科其他植物的凝集素和类似蛋白的保守区的DNA序列,设计了几个海芋凝集素基因aml特异引物（GSP）。用RNeasy试剂盒从海芋块茎中提取出总RNA,并以此为模板,用SMART^TM RACE cDNA扩增试剂盒提供的经特殊设计的通用引物以及不同的基因特异引物,分别获得海芋凝集素5′-和3′-RACE-PCR扩增片段。这些PCR产物经0．8％琼脂糖凝胶纯化后,分别与T克隆载体pMD 18-T相连,筛选获得阳性克隆并提取质粒,经双酶切和特异引物的PCR验证无误后,进行序列分析。从5′-和3′-RACE-PCR测序结果拼接出全长海芋凝集素cDNA序列,并用新设计自5′-RACE-PCR 5′末端的引物GSP7进行全长3′-RACE-PCR反应,获得全长海芋凝集素cDNA克隆并再次测序验证。这一新克隆的海芋凝集素cDNA的长度为1124核苷酸,分析表明它是一个编码270个氨基酸残基的蛋白质,其等电点为pH 5．7,相对分子量为29．7kD。同源性分析结果表明,海芋凝集素与其他来源于天南星科的甘露糖凝集素以及相似蛋白具有高度同源性。在海芋凝集素序列中发现了2个B型凝集素功能区域和3个甘露糖的结合位点。综合上述信息,认为这一新克隆的海芋凝集素cDNA是一个编码甘露糖识别凝集素的基因序列。