植物表达抗体的研究与发展

利用植物表达抗体是近年来兴起的植物基因工程的一个新领域.它将编码抗体或抗体片段的基因导入植物,从而在植物中产生全长抗体或抗体片段.利用植物表达抗体最诱人的潜在用途是可以大规模廉价生产治疗和诊断用抗体.此外,植物抗体还能够通过调控植物代谢改良植物性状并赋予植物对病虫害的抗性.目前植物抗体的商品化还存在一些问题.     

金标免疫渗滤法与常规ELISA法对比检测抗幽门螺杆菌抗体的研究

用ＤＩＧＦＡ单盲检测各类胃病患者血清ＨＰ特异性抗体,结果表明其敏感性为９７９％,特异性为９１５％,诊断效率达９４７％,ｙｏｕｄｅｎ’ｓ指数为０８９。通过本法与常规ＥＬＩＳＡ比较,发现两法前四种诊断指标均无明显差异,但ＤＩＧＦＡ简易、快速,无需任何设备,数分钟内即可得出正确结论,因此适合于基层医院查病、胃镜检查前过筛及流行病学调查应用     

抗癌胚抗原单链抗体基因的构建及高效表达

采用重组ＰＣＲ技术将已获得的抗癌胚抗原鼠源单克隆抗体Ｅ７Ｂ１０重,轻链可变区基因经（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）３编码的寡核苷酸拼接成单链抗体基因,并在大肠杆菌中高效表达了单链抗体Ｃ端的融合蛋白,其表达量达到菌体总蛋白的２０％,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹图谱显示表达产物分子量为２７ｋＤ,与其基因编码蛋白的理论推算值相符。     

棉铃虫β-catenin的多克隆抗体制备及在蛹脑中的表达研究

β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路的重要成员。本研究构建β-catenin的原核表达载体,成功地在大肠杆菌Escherichia coli中进行表达。镍柱纯化重组蛋白后免疫兔子,制备了抗棉铃虫β-catenin的多克隆抗体。ELISA和Western blot的方法检测抗体效价和抗体特异性,结果表明抗体的效价较高,特异性较好。最后应用该抗体调查了滞育和发育蛹脑中β-catenin的表达情况,从蛋白水平证实了发育蛹脑中β-catenin高于滞育蛹脑。本研究为后续研究棉铃虫β-catenin的功能以及Wnt/β-catenin信号通路在棉铃虫发育中的作用奠定了基础。     

树鼩脐带间充质干细胞与抗小鼠、人CD抗体的交叉反应性

目的观察树鼩的细胞是否与抗鼠或抗人的CD抗体反应。方法采树鼩外周血与小鼠的CD3、CD4、CD8抗体反应。再分离培养树鼩的脐带间充质干细胞,分别与抗小鼠的CD29-FITC、Sca-1-PE、CD90-PE反应,与抗人的CD44-FITC、CD29-FITC、CD13-FITC、CD34-FITC反应。结果树鼩外周血与小鼠的CD3、CD4、CD8抗体不发生反应,但树鼩的脐带间充质干细胞与抗小鼠的CD29-FITC抗体发生反应,阳性率为99.8﹪。树鼩的脐带间充质干细胞与抗人的CD44-FITC抗体发生反应,阳性率为99.7﹪。结论树鼩的外周血与小鼠的CD抗体不反应,但树鼩的脐带间充质干细胞与小鼠的CD29-FITC抗体和人的CD44-FITC抗体反应效果较好。     

抗人红细胞单链抗体与猪瘟E2蛋白双功能融合蛋白的构建及生物学活性检测

为构建具有凝集性、免疫反应性的双功能融合蛋白,本研究采用重叠延伸PCR方法将2E8ScFv(抗人红细胞H抗原单链抗体基因)和mE2(猪瘟病毒E2蛋白主要抗原编码区基因)拼接成融合基因2E8mE2,并插入原核表达载体pET-DsbA,将重组表达质粒pET-DsbA-2E8mE2转化入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)PlysS中进行IPTG诱导表达,表达的融合蛋白经SDS-PAGE和Western blotting分析鉴定,结果表明:2E8mE2融合基因在大肠杆菌中获得了表达,表达产物以包涵体形式存在,分子量约为65kDa,与预期的大小一致。分别采用亲和层析法和谷胱甘肽再氧化法对融合蛋白进行纯化和复性,红细胞凝集试验证实:2E8mE2融合蛋白复性效果良好,既能够与人红细胞结合,又能够与猪瘟病毒抗体反应,具有双功能特性。     

双特异性抗体在肿瘤治疗中的研究

双特异性抗体(bispecific antibody,BsAb)有两个抗原结合位点,其中一个位点可与靶细胞表面抗原结合,另一个位点则可与载荷物(如效应细胞,分子等)结合。将BsAb应用于肿瘤治疗,发挥抗肿瘤效应的思想已有二十多年历史,随着对效应细胞生物学了解的加深和抗体工程的飞速发展,各种形式的BsAb相继出现,多种BsAb药物已进入临床初期试验或治疗使用阶段。本文就BsAb的各种新形式及其在肿瘤治疗中的应用新进展作简要概述。     

嵌合内含子对抗bFGF抗体基因在293T细胞中表达的影响

目的：构建含嵌合内含子和抗bFGF抗体基因的真核表达载体并在293T细胞中表达,探讨嵌合内含子对抗体表达的影响。方法：设计引物分别从载体pCl-neo和pComb3-Fab25中扩增出内含子和抗体Fd段、κ链基因序列,按不同组合构建到含人免疫球蛋白IgG1恒定区Fc段基因的表达载体pIgG中。重组质粒经脂质体PEI转染293T细胞,荧光显微镜观察质粒转染情况,采用夹心ELISA和Western blot检测细胞上清中抗体的表达。结果：DNA测序和酶切分析表明,内含子和抗体基因成功插入pIgG,获得了重组质粒pIgG-Fd-κ、pIgG-Fd-intron-κ、pIgG-Fd-κ-intron和pIgG-Fd-intron-κ-intron。倒置荧光显微镜下可观察EGFP大量表达,Western blot分析上清中有抗体的表达,夹心ELISA检测pIgG-Fd-κ、pIgG-Fd-intron-κ、pIgG-Fd-κ-intron和pIgG-Fd-intron-κ-intron抗体表达量分别为1.21mg/L、0.468mg/L、7.39mg/L、0.601mg/L。结论：成功构建了含嵌合内含子和抗体基因的真核表达载体并在293T细胞中得到表达。嵌合内含子插入κ链基因5’端可提高抗体的表达,插入Fd段5’端则抑制抗体的表达。     

人DFF45蛋白多克隆抗体制备及其初步应用

目的：表达、纯化带GST标签的DNA裂解因子45（DNA fragmentation factor 45 ,DFF45）融合蛋白并制备多克隆抗体。方法：构建pGEX-5X-1/DFF45原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导融合蛋白表达,经纯化后免疫日本大耳白兔得到多克隆抗体并用CNBr-activated Sepharose? 4B进行纯化。用间接ELISA法检测抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性,同时用免疫荧光染色鉴定抗体特异性并观察DFF45的细胞定位。进一步检测DFF45在人类几种细胞系的表达差异情况。结果：成功构建原核表达质粒,表达、纯化DFF45蛋白并免疫动物后得到多克隆抗体。间接ELISA法显示抗体效价达1:20 000,Western blot确定抗体具有高度特异性。应用该抗体检测发现DFF45在人类几种细胞系中表达存在差异并观察到其细胞定位。结论：DFF45多克隆抗体的成功制备及其在人类细胞系的差异表达,为进一步研究DFF45基因与肿瘤及其相关疾病的关系奠定了基础。     

人源天然ScFv噬菌体抗体库的构建及鉴定

噬菌体抗体库技术是获得治疗性抗体的一条重要途径。以20份健康人外周血为样本,通过提取淋巴细胞、逆转录－PCR（RT PCR）、抗体可变区基因的扩增、重叠PCR获得单链抗体（ScFv）基因,将ScFv克隆入噬粒载体,通过近300次的电转化获得了库容量为1.3×109的全人源天然ScFv噬菌体抗体库。通过随机挑克隆测序和用5种不同抗原筛选对抗体库进行了初步验证。随机测序表明抗体库具有较好的多样性,用5种不同抗原对其进行筛选,均获得了特异性噬菌体抗体的不同富集,表明成功构建了一个多样性良好的人源天然ScFv噬菌体抗体库。