玉米microRNAs及其靶基因的生物信息学预测

microRNAs (miRNAs) 是一类非编码的小分子RNA, 通过碱基互补调控靶基因的表达。鉴定和发现新的miRNAs及其靶基因, 对揭示miRNAs在基因表达调控中的作用至关重要。玉米全基因组测序工作开展较晚, 已经鉴定登记的miRNAs很少, 对靶基因的调控作用尚待解明。文章根据miRNA进化上的保守性, 以已知的植物miRNAs为探针, 与相关数据库中玉米表达序列标签(EST)和基因组序列(GSS)中的非编码序列比对, 共发现11个新的miRNA前体。虽然在序列长度和二级结构方面各有变化, 但这11个前体均可折叠形成miRNA家族的标准二级结构。通过靶基因预测, 找到其中7条miRNAs的26个靶基因, 分别编码与新陈代谢、信号转导、转录调节、跨膜运输、生物和非生物胁迫及叶绿体组装等相关的蛋白。这些miRNAs及其靶基因的鉴定, 补充了miRNA数据库的不足。     

一株分离自高海拔土壤的梭菌的鉴定及代谢产物

【目的】了解土壤环境中细菌的生理生化特性及代谢产物。【方法】采用厌氧操作技术从西藏纳木错分离到一株厌氧梭状芽孢杆菌P4-1。采用生理生化鉴定结合16SrDNA序列的系统发育学分析确定该菌株的系统发育地位,用气相色谱分析其代谢产物【结果】菌株P4-1为严格厌氧革兰氏阳性菌,菌体大小为0.3μm×1μm-3μm,单生或成对生长,产生芽孢。生长温度范围是13-40℃(最适温度37℃);NaCl浓度0%-5%(最适为0.5%-1%);pH范围5.0-10.0(最适生长pH为7.5-8.0)。能够利用葡萄糖、密二糖、甘露糖醇等多种碳水化合物,发酵葡萄糖的产物是乙酸,丙酸,丁酸,CO2,H2。菌株P4-1的(G+C)mol%含为30.9%,与Clostridium lituseburense DSM797(M59107)的相似性达98.7%。菌株P4-1能够降解对甲苯磺酸盐,并且在有酵母粉的情况下能明显提高其降解能力【结论】菌株P4-1是从土壤中分离出的一株耐低温,耐盐的厌氧菌,其发酵葡萄糖产生的代谢产物有利于改善土壤中的微环境,而且能够降解对甲苯磺酸盐,在废水处理中有重要意义。     

大肠杆菌-链霉菌穿梭表达载体pMF的构建及其应用

【目的】构建能定点整合到链霉菌(Streptomyces)染色体上的高效表达载体。【方法】以链霉菌自杀型表达载体pLSB2为基础,通过插入链霉菌噬菌体ΦC31整合酶基因int和attP位点(Phage attachment site),构建了能在大肠杆菌和链霉菌之间进行接合转移并定点整合到链霉菌染色体上的表达载体pMF。将pMF转化大肠杆菌ET12567(pUZ8002),并分别接合转移天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolorM145)、变铅青链霉菌(Streptomyces lividansTK24)和红色糖多孢菌(Saccharopolyspora erythraea2338),挑取接合子进行PCR和Southern杂交检测。将来自刺糖多孢菌S08-4的S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(SAM-s)克隆到载体pMF的启动子下游,接合转移到天蓝色链霉菌中。【结果】表明pMF成功整入链霉菌染色体,并且检测到目的蛋白的表达。【结论】构建的pMF载体可作为外源基因定点整合表达的有效工具,为后续的基因功能研究以及链霉菌的遗传改造奠定了基础。     

洋葱伯克霍尔德菌脂肪酶的基因改造及其在毕赤酵母中组成型和诱导型的表达

【目的】克隆洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)脂肪酶基因,实现其在毕赤酵母中快速、安全和稳定性的大量表达。【方法】首先设计引物扩增B.cepacia脂肪酶基因,然后应用生物信息学方法分析B.cepacia和毕赤酵母整体密码子使用情况、脂肪酶基因信号肽及密码子偏好性。在此基础上,运用overlap PCR对脂肪酶基因中低使用频率密码子进行改造并同时降低基因的G+C含量,获得优化的脂肪酶基因。再分别把原始和优化的脂肪酶基因导入载体pGAPZα和pPIC9K中,获得组成型表达载体pGAPlipW、pGAPlipO和诱导型表达载体pPIClipW、pPIClipO。分别将所得4种载体转入GS115中,得到一系列工程菌。经发酵和NTA树脂纯化后,对脂肪酶的酶学性质进行了初步研究。【结果】4种工程菌的脂肪酶活力分别为pPIClipW37.8U/mL,pPIClipO129.5U/mL,pGAPlipW40.2U/mL和pGAPlipO184.3U/mL。改造后脂肪酶活力比原始脂肪酶提高了4.6倍。酶学性质研究表明,脂肪酶在60℃时活力最高,在40℃-65℃范围内非常稳定;脂肪酶最适pH值为9.0,在pH6.0-pH10.0范围均表现很好的稳定性。【结论】通过overlap PCR改造后的脂肪酶显著提高了其在毕赤酵母中的表达效率,且GAP启动子比AOX1启动子更适合于B.cepacia脂肪酶的表达。大量表达的重组脂肪酶的性质与野生脂肪酶的性质相同,符合生产要求。     

瘤胃中木质纤维素降解菌及降解酶基因的研究进展

摘要：反刍动物瘤胃是公认的木质纤维素高效降解的天然反应器,对瘤胃微生物的研究成为开发生物能源的热点领域之一。其研究手段已经从传统的依赖分离培养从瘤胃中获得木质纤维素降解菌,并对降解菌中的木质纤维素降解酶逐一分析,发展到通过基因组/元基因组技术,直接从瘤胃中发现获得大量新的木质纤维素降解酶基因/基因簇,进而探讨其降解的分子机理。已有的研究结果表明,瘤胃微生物降解木质纤维素的过程非常复杂,其中涉及到大量不同种类的微生物、酶及基因/基因簇,随着新分析技术的建立和完善,对这些微生物、酶和基因的研究已取得了诸多进展。本论文综述报道了近期有关该方向的研究进展。     

环境因素对东平湖沉积物细菌群落结构的影响

【目的】探讨环境因素对东平湖沉积物细菌群落结构的影响。【方法】应用T-RFLP(Terminal RestrictionFragment Length Polymorphism)技术分析和比较了6个不同位置的东平湖沉积物在丰水期和枯水期的细菌多样性,并结合不同样品环境因子的差异,采用主成分分析(PCA)和典型对应分析(CCA),探讨了环境因子对细菌多样性的影响。【结果】不同沉积物样品的T-RFLP图谱具有较高的相似性。除2号样品外,所有枯水期样品的细菌群落具有较高的丰富度、多样性、均匀度和较低的优势度。CCA结果表明,558bp T-RF的丰度与总磷、总氮、总有机碳、铵态氮和硝态氮含量呈负相关而与碳氮比和水深呈正相关;64.5、164、509和543bp T-RFs的丰度与总氮、总有机碳、铵态氮、硝态氮、碳氮比和水深呈正相关;而其它14种主要的T-RFs在不同样品间分布较为稳定受环境因子影响不大。90、136.5、138和488bp等T-RFs可能代表了东平湖沉积物中占优势地位的土著菌群。通过Phylogenetic Assignment Tool在线分析结果推测,东平湖沉积物中的优势菌群可能属于Firmicutes和Proteobacteria门。【结论】环境因素对东平湖沉积物的细菌多样性产生显著影响,但对其土著菌群的影响不大。     

乙酰辅酶A合成代谢对酿酒酵母生理功能的影响

【目的】研究酿酒酵母(Saccharomycesc erevisiae)中乙酰辅酶A合成酶基因ACS1和ACS2的生理作用。【方法】将来源于S.cerevisiae的ACS1和ACS2分别进行过量表达,研究过量表达ACS1和ACS2后S.cerevisiae胞内乙酰辅酶A含量、ATP水平、甲羟戊酸途径转录和乙醇耐受性等生理学特性变化。【结果】与出发菌株相比,过量表达ACS1和ACS2使得:(1)胞内乙酰辅酶A含量提高了2.19倍(ACS1)和5.02倍(ACS2);(2)胞内ATP含量提高了3.93倍(ACS1)和2.05倍(ACS2);(3)甲羟戊酸途径8个关键基因表达量显著上调;(4)S.cerevisiae对乙醇胁迫抵御能力显著增强。过量表达ACS1对乙醇胁迫的耐受能力强于过量表达ACS2。【结论】增加胞内乙酰辅酶A的含量可以显著增加甲羟戊酸途径碳代谢流量,并增强S.cerevisiae对发酵过程主要副产物乙醇的耐受能力。     

转录因子SoxR的结构、调控机制及生理功能

转录因子SoxR是典型的汞抗性操纵子调节因子家族的成员,广泛存在于变形菌门、放线菌门、酸杆菌门等微生物类群中。SoxR感受胞内氧化还原电势,通过铁硫簇失去一个电子,而激活目标基因的表达。SoxR在大肠杆菌中能应答过氧化物,负责抗氧化胁迫的全局性调控;在铜绿假单胞菌中受群体感应终端信号分子绿脓菌素的激活,参与群体对环境变化的协同应答过程。本文综述了SoxR的结构、作用机制和生理功能。近年来关于SoxR的研究虽然已取得许多令人瞩目的成果,但SoxR激活的分子机制仍有待确立和验证,同时也亟待在更多微生物类群中开展相关研究。对这些问题的深入研究,不仅可以更全面地认识SoxR,而且可以对微生物体的整个代谢调控网络有更加深入地了解,并有可能获得里程碑式的重大发现。     

禽病原性大肠杆菌aes-31基因突变株的构建和致病性鉴定

【目的】通过禽病原性大肠杆菌(APEC)aes-31突变株的构建和动物实验来初步鉴定此基因片段对E058株的毒力影响。【方法】对在芯片杂交试验中筛选到的APEC E058株体外表达差异基因片段aes-31(来自SSH方法筛选到的E058株特异片段),用SSH引物从重组质粒中扩增出目的片段,克隆到pGEM-Teasy Vector中,然后用SphⅠ和SpeⅠ从中切下此片段,将之克隆到pMEG-375自杀性载体中,构建自杀性重组质粒pMEG375-aes-31,将突变载体转化到受体菌中,再和APEC E058株进行固相杂交,根据同源重组原理,筛选出基因突变株E058(Δaes-31)。【结果】E058株和突变株的LD50没有明显差别,突变株对35日龄SPF鸡的致死率高于E058株;两者接种鸡6 h内,E058(Δaes-31)突变株在各内脏器官和血液中的细菌数和E058株差异均不显著;接种鸡24 h后,E058(Δaes-31)突变株在脾脏和肺中的细菌数显著大于E058株,差异显著,E058(Δaes-31)突变株在心脏、肝脏和血液中细菌数显著大于E058株,差异极显著;接种鸡48 h后,E058(Δaes-31)突变株在心脏、肝脏和脾脏中的细菌数比E058株多,差异极显著,而肺脏和血液中的细菌数均无明显差异;48 h后突变株所引起的感染鸡的大肠杆菌病变比亲本株稍严重。【结论】以上数据表明aes-31有可能与E058株毒力的负调控有关。     

聚合酶链反应-酶切分型鉴定广州地区环境水源军团菌

【目的】探讨聚合酶链反应-酶切分型在快速鉴定环境水源军团菌方面的应用价值,并了解广州地区环境水源军团菌的分布状况。【方法】对广州地区采集的44份环境水样,作军团菌分离培养,再对分离菌株进行16Sr DNA PCR-酶切分型鉴定、16S rDNA基因测序和mip基因测序鉴定。【结果】在广州地区环境水源分离的112株军团菌,经聚合酶链反应-酶切分型鉴定、16S rDNA基因测序和mip基因测序鉴定,检出嗜肺军团菌66株,非嗜肺军团菌46株,其中菲氏军团菌20株,戈氏军团菌17株,橡树岭军团菌7株,长滩军团菌2株。【结论】聚合酶链反应-酶切分型检测环境水源军团菌是一种简便、快速、特异的鉴定方法;在广州地区环境水源中普遍存在军团菌,主要是嗜肺军团菌,其次是菲氏军团菌,戈氏军团菌,橡树岭军团菌和长滩军团菌。