组蛋白修饰对酿酒酵母复制起始相关蛋白基因表达的调控

真核生物的DNA复制是一个复杂且有序的过程,其中DNA复制起始参与调控众多生物学活动,对生物正常的生长发育具有重要作用。组蛋白修饰在调节DNA复制过程中具有重要作用。为了检测组蛋白特定位点的修饰对DNA复制起始的影响,本研究以酿酒酵母组蛋白H3/H4定点突变菌株为研究对象,采用倍比稀释表型分析法检测了组蛋白11种H3/H4甲基化、乙酰化突变菌株的生长情况,显示,以野生型菌株BY4741为对照,组蛋白H3/H4乙酰化突变菌株H3K64A、H3K56A、H3K14Q、H4K5R、H4K16Q以及组蛋白H4甲基化突变菌株H4K20Q表现为生长缺陷,其他菌株与BY4741生长情况基本一致;通过GeNorm和NormFinder软件分析得出本实验最适内参基因为β-actin;采用Real-time PCR检测了菌株细胞内复制起始相关蛋白基因mcm2、mcm10、cdc45的表达情况,表明,组蛋白H3/H4甲基化突变菌株H3K9A、H3R72K、H4K59A、H4K20Q胞内mcm2、mcm10、cdc45基因表达均显著下调(p0.01),而H4R3A胞内mcm2、mcm10表达显著上调(p0.05)、cdc45显著下调(p0.01),组蛋白H3/H4乙酰化突变菌株H3K14Q、H4K5R、H4K8A、H4K16Q胞内mcm2表达显著下调(p0.01),而在H3K64A、H3K56A胞内无显著变化,mcm10在6种组蛋白H3/H4乙酰化突变菌株内表达均下调(p0.01),cdc45基因在H4K5R胞内表达无显著变化,在其余5种乙酰化突变菌株中表达均显著下调(p0.01),为进一步阐明组蛋白特定位点修饰调控DNA复制起始的深入研究提供理论帮助。     

细胞培养过程对单克隆抗体糖基化修饰的影响和调控

在单克隆抗体药生产过程中,其糖基化修饰可能受到多种工艺参数的影响,因而容易产生异质性,并且抗体糖基化和抗体半衰期、免疫源性、ADCC、CDC等密切相关,所以单克隆抗体的糖基化修饰是重要的质量属性,需要在生物药尤其是生物类似药开发过程中重点关注,并加以调控。通过概述培养过程中的细胞株、培养工艺,以及培养基对糖型的影响,讨论如何在工艺开发过程开展研究,确保产品糖基化的一致性,从而保证单抗药物的疗效及安全性。     

mRNA表观修饰方式及m6A功能研究进展

mRNA上能发生100多种化学修饰,其中N~6-腺嘌呤(m~6A)是mRNA修饰中最广泛的表观修饰方式之一。在细胞分化、胚胎发育和应激等生物学过程中,特定的mRNA会发生包括N~1-腺嘌呤甲基化、N~5-胞嘧啶甲基化、假尿嘧啶以及N`6-腺嘌呤甲基化等修饰,它们共同形成了mRNA转录后调控的表观修饰转录组,实现对mRNA翻译成蛋白质过程的精确时空调控,特别是m~6A修饰能通过调控mRNA的代谢和翻译等进而调控细胞的一系列生物学过程。文中主要综述mRNA的表观修饰类型和特点,特别是m~6A修饰参与调控mRNA和细胞生物学功能的最新研究进展,并展望了将来m~6A表观修饰的研究重点和方向。     

氧化应激下角质形成细胞中YTHDC1升高促进IL-1β表达

摘要 目的：探讨氧化应激下角质形成细胞内m6A甲基化修饰酶YTHDC1异常对促炎因子的调控机制。方法：通过Western blot和qRT-PCR实验检测氧化应激下角质形成细胞中YTHDC1蛋白和mRNA表达水平。siRNA转染至角质形成细胞以干涉YTHDC1表达,随后继续给予300 μM过氧化氢处理,通过Western blot和qRT-PCR实验检测角质形成细胞中促炎因子IL-1β蛋白和mRNA表达,进一步通过ELISA检测细胞上清中IL-1β分泌,通过CCK8法检测细胞存活水平。结果：1）过氧化氢刺激后人角质形成细胞系HaCaT细胞中YTHDC1表达水平较未处理组明显升高;2）干涉YTHDC1可以显著降低HaCaT细胞中IL-1β表达和上清中分泌;3）干涉YTHDC1后IL-1β mRNA稳定性下降,并且细胞存活率下降。结论：氧化应激下角质形成细胞中m6A甲基化修饰酶YTHDC1表达水平升高,通过提高mRNA稳定性促进IL-1β表达,可能是外界环境应激引起各种免疫性皮肤病的重要机制。     

烯醇化酶1多肽共价修饰改变细胞的生长和代谢模式

文章利用斑马鱼胚胎成纤维细胞(PAC2), 研究烯醇化酶1(Enolase1, ENO1)多肽生化功能及其共价修饰的影响。首先体外合成甲基修饰、乙酰修饰、磷酸修饰和未修饰的ENO1多肽, 分别处理PAC2细胞, 然后检测处理细胞CCK-8、胞内外乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase, LDH)和二磷酸甘油酸(2-phosphoglycerate, 2-PG)相对含量; 以及线粒体和溶酶体完整性; 同时利用PCR ARRAY试剂盒比较葡萄糖代谢通路变化。结果表明不同修饰的多肽处理后, 细胞增殖, 溶酶体和线粒体形态, 以及糖代谢通路发生了不同程度的改变。为了进一步研究乙酰化修饰ENO1多肽促进细胞增殖的代谢机制, 又将乙酰化修饰的多肽和空白对照处理的PAC2细胞进行转录组测序。转录组分析进一步显示乙酰化修饰的ENO1多肽可以改变糖、脂、蛋白质代谢途径, 并激活与癌症和病毒感染病的KEGG通路。研究结果提示烯醇化酶1的多种生化功能可能是蛋白翻译后不同化学修饰的结果。     

假单胞菌Pseudomonas fluorescens Pf0-1中转录调控因子SpfB负调控DNA磷硫酰化修饰

[目的]DNA磷硫酰化修饰是DNA骨架上非桥接的氧原子以序列选择性和R-构型被硫取代的一种新型DNA修饰。目前,磷硫酰化修饰在多种细菌、古生菌以及人类致病菌中多有发现,但其分子调控机制尚不清楚。为了全面解析磷硫酰化修饰的调控机制,本文选择荧光假单胞菌Pf0-1为研究对象,开展了其DNA磷硫酰化修饰的调控机制研究。[方法]首先,构建了spfB基因缺失和回补菌株,使用碘能特异性断裂磷硫酰化修饰DNA的方法,研究了该基因缺失对修饰表型的影响。利用cDNA在相邻同方向的基因间隔区进行PCR,确定了磷硫酰化修饰基因簇spfBCDE内的共转录单元。通过荧光定量RT-PCR,分析了spfB基因缺失突变株中磷硫酰化修饰基因的转录量。利用异源表达并纯化得到的重组蛋白SpfB进行了体外功能研究。通过EMSA实验,验证了SpfB蛋白具有与spfB启动子序列结合活性。通过DNase I footprinting实验,精确定位了SpfB蛋白与DNA结合序列。[结果]spfB基因的缺失加剧了磷硫酰化修饰DNA断裂所致电泳条带弥散的表型,spfB基因的回补能够恢复该表型,证明spfB基因负调控磷硫酰化修饰。鉴定了spf基因簇中只含有1个共转录单元,且该共转录单元在△spfB突变株中转录水平明显上升。通过EMSA和DNase I footprint实验,检测了SpfB蛋白与磷硫酰化修饰基因spfBCDE的启动子区域5''-TGTTTGT-3''相结合。[结论]SpfB作为转录调控因子负调控磷硫酰化修饰基因spfBCDE的表达,为解析磷硫酰化修饰的调控机制和全面理解基因组上的部分修饰特征奠定了基础。     

基于DNA弯曲度的H2A.Z核小体定位与修饰研究

在真核生物染色质中,H2A.Z是高度保守的组蛋白变异体,与转录调控、基因组的稳定性密切相关。为了探讨组蛋白修饰、DNA弯曲度与H2A.Z核小体定位三者之间的关联,在得到实验所测的相关数据后,利用MINE算法并结合皮尔逊相关系数在酵母全基因组的转录起始位点周围探讨了三者间的线性与非线性关系。其中MIC算法可以定量的得出数据之间关联度大小的值,用于衡量数据之间是否存在着关联,而皮尔逊相关系数则用于检查是否为线性关联。结果除了发现大部分组蛋白修饰种类和核小体定位之间存在着线性关联外,还探测到有两种组蛋白修饰数据(H4ac修饰与GCN4修饰)和核小体定位数据之间存在着以往未发现的非线性关系(大致呈正余弦函数),并从数据的生物背景(组蛋白修饰与核小体位置)上探讨了出现非线性现象的原因。     

利用CRISPR/Cas9系统检测果蝇细胞中组蛋白甲基化修饰对20E信号传导的调控

[目的]利用CRISPR/Cas9基因敲除系统在黑腹果蝇Drosophila melanogaster细胞中筛选并检测组蛋白甲基化修饰对蜕皮激素20-羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)信号传导的调控.[方法]通过Flybase网站分析并总结黑腹果蝇组蛋白甲基转移酶及其修饰位点;将5个组蛋白甲基转...     

TRPV6离子通道结构及蛋白翻译后修饰的研究进展

TRPV6(transient receptor potential vanilloid 6)是一种高表达于胃肠道的阳离子通道,对Ca²⁺具有较高的渗透性,参与调控细胞增殖、迁移、凋亡以及多种疾病的发生与发展,是常染色体隐性新生儿暂时性甲状旁腺功能亢进症的致病基因。该文以TRPV6的离子通道结构为出发点,系统阐述了TRPV6的抑制剂、其它调控蛋白对TRPV6通道活性的影响、TRPV6蛋白翻译后修饰及在机体多种疾病中的调控作用,为后续研究翻译后修饰对其通道的功能调节提供依据,以期推动TRPV6通道参与的癌症及相关药物的开发。     

放线菌来源的羊毛硫肽研究进展

羊毛硫肽(lanthipeptide)是一类由核糖体合成并经翻译后修饰的含羊毛硫氨酸或β-甲基羊毛硫氨酸的多肽。近年来,放线菌来源的羊毛硫肽因其突出的抗菌活性和罕见的生物活性而备受关注。本文重点对放线菌来源的不同类型的羊毛硫肽的结构特征及其特性进行了综述,讨论了生物或化学方法修饰天然羊毛硫肽和基因组挖掘发现结构新颖的羊毛硫肽在开发符合实际应用需求的放线菌来源的羊毛硫肽中的应用,并对放线菌来源的羊毛硫肽的应用潜力进行了总结和展望。