大鼠脑神经元特异性烯醇化酶基因的cDNA克隆及序列分析

用ＲＴ－ＰＣＲ方法快速克隆了Ｗｉｓｔａｒ大鼠脑神经元特异性烯醇化酶（ＮＳＥ）的ｃＤＮＡ,将此包括编码全长ＮＳＥ４３３个氨基醚的ＤＮＡ片段重组入ｐＵＣ质粒,并用ＰＣＲ方法测定了全部顺序,经重复实验,发现Ｗｉｓｔａｒ大鼠与Ｆｏｒｓｓ－Ｐｅｔｔｅｒ报导的ＳＤ大鼠ＮＳＥ基因顺序,有两外单碱基的差别,其中一个涉及氨基酸的改变。同时还对ＲＮＡ的提取及长片段ＤＮＡ的ＲＴ－ＰＣＲ扩增进行了方法学的探讨。     

戊型肝炎病毒中国XT—179株全基因组Cdna克隆及其核苷酸和氨基酸序列分析

本文报道对中国新疆东部一起戊型肝炎流行高峰期间,由ＨＥ患者烘便中分离到的型肝炎病毒中国ＸＴ－１７９株进行全基因ｃＤＮＡ克隆、核苷酸和氨基酸序列测定及分析结果。所阐明的ＨＥＶ－ＸＴ－１７９株基因组全序列由７１９４个核苷酸和３＇端的多聚腺嘌呤核苷酸尾组成。四种核苷酸的含量腺嘌呤（Ａ）为１７．０％,胞嘧啶（Ｃ）为３１．９％,鸟嘌呤（Ｇ）为２６．０,尿嘧啶（Ｕ）为２５．１％。Ｇ＋Ｃ含量为５７．９％。全基因     

谷氨酸棒状杆菌启动子在枯草芽孢杆菌中的克隆及其序列分析

利用枯草芽孢杆菌启动子探针质粒pPL 603为载体,从谷氨酸棒状杆菌1014—6染色体DNA上克隆到一个有较强启动功能的DNA片段。生物素标记的DNA—DNA分子杂交实验证明该片段确实来自谷氨酸棒状杆菌1014—6染色体DNA。在绘制该片段限制酶酶切图谱的基础上,经另一个启动子探针质粒pPL 703的亚克隆,将其启动子功能区定位在Bamm酶切片段中。对后者进行了核苷酸序列分析,发现它具有棒状杆菌类启动子的－35区和－10医序列。     

人尿激酶原cDNA在中国仓鼠卵巢细胞(CH0)中高效表达研究

通过构建高效表达载体,改进转染方法,与二氢叶酸还原酶(dhfr)基因共扩增等手段在CH0细胞内高效表达了人尿激酶原(Pr0-UK)cDNA。首先将pro—UK cDNA插入到sR α启动子的下游,构建成表达质粒pMGl0102,在cos－7细胞内进行暂时性表达,结果表明此启动子的表达水平比SV40早期启动子高约5倍。然后将质粒pMG10102和pSV2－dhfr线性化后用磅酸钙共沉淀法转染CH0－dhfr-细胞,经一系列筛选后获得20个能表达pro—UK的细胞克隆,纤维蛋白溶解平板法(FAPA)测定表达水平为12．5—100IU／10⁶cells／d．再经MTX加压共扩增,得到9株高表达细胞系,其中最高的表达水平达到400—500Iu／10‘cells／d。2—3个月连续传代,表达水平未下降,表明细胞株是稳定的。Western Blot分析证明细胞分泌的重组pro－UK具有与天然pro—UK相同的分子量,而且培养液中不加蛋白酶抑制剂时,分泌的重组UK大部分为单链(60％以上)。     

利用噬菌体展示技术筛选草鱼呼肠孤病毒VP39蛋白相互作用多肽

VP39是草鱼呼肠孤Ⅲ型病毒(GCRV GenotypeⅢ, GCRV-Ⅲ)S9基因编码的蛋白,为研究VP39蛋白在GCRV-Ⅲ感染草鱼细胞过程中行使的生物学功能,将克隆VP39基因序列并构建原核表达载体pET32a-VP39,通过原核表达得到VP39-HIS融合蛋白;利用VP39蛋白溶液免疫小鼠,制备鼠抗VP39多克隆抗体,通过Western Blot对抗体进行评估;利用制备的多克隆抗体探究GCRV-Ⅲ感染细胞过程中VP39蛋白表达动力学;利用噬菌体展示技术筛选与VP39蛋白特异性结合的多肽序列并进行分析。SDS-PAGE电泳结果显示, VP39-HIS融合蛋白可良好溶于PBS中,蛋白大小约为39 kD; Western Blot检测表明实验所制备的VP39多克隆抗体在1:10000稀释比例下,既能识别原核表达的VP39-HIS融合蛋白,也能识别GCRV-Ⅲ感染CIK细胞后表达的VP39蛋白,具有良好的效价与特异性;在病毒侵染过程中, VP39前期表达量较少,在中后期大量表达;噬菌体展示技术筛选出两条多肽与VP39蛋白有高度亲和性,经过在NCBI上比对后发现草鱼基因组中有7个基因与筛...     

核酶设计、合成与克隆的一种新方法

介绍了一种设计、合成与克隆人造核酶的新方法.通过在“锤头结构”模型中非保守性区域引入 Bgl I 切点,不仅维持了核酶切割活性所必需的二级结构,而且为核酶克隆的鉴定提供了极为方便的手段.另外还通过在核酶模板两端引入限制性内切酶半切点,一步直接将核酶模板连接、聚合、克隆到体外转录载体上,大大简化了以往核酶克隆的繁琐操作,省时、省力,克隆效率也较高.