猪圆环病毒2型流行株的分离及其感染性克隆的构建

【目的】通过分离一株猪圆环病毒2型(PCV2)流行毒株,并构建其感染性克隆,为研究PCV2基因功能提供操作平台。【方法】通过PCR方法,从疑似患断奶仔猪多系统衰竭综合症(PMWS)的仔猪淋巴结中鉴定为猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)2型阳性。把阳性病料接种PK-15细胞传代培养,在培养物中扩增出PCV2的全基因序列。对扩增出的全序列进行序列测定,并与GenBank中公布的5株广东PCV2分离株(GD-pz、GD-gj、GD-jm、GD-ss和GD-sz)进行同源性分析。通过EcoRⅠ和SalⅠ将PCV2全基因组序列克隆进pUC18载体中,获得含PCV2 GD-zq株全基因组单拷贝的重组质粒pPCV2-GD-zq,再通过SalⅠ和HindⅢ把另一个全长拷贝克隆进pPCV2-GD-zq质粒中,使PCV2 GD-zq株基因组DNA以头尾相接的双重复方式克隆进pUC18载体中,获得重组质粒pPCV2-2GD-zq。将pPCV2-2GD-zq DNA纯化和定量后转染PK-15细胞,拯救PCV2 GD-zq病毒。【结果】从PMWS感染的猪淋巴结中分离到了一株PCV2,命名为GD-zq株;序列分析结果显示,GD-zq株全基因组为1 767 bp,与GenBank中公布的5株广东PCV2分离株ORF1核苷酸一致性为97.1%-99.7%,编码氨基酸一致性为98.7%-100%;ORF2核苷酸一致性为93.2%-99.6%,编码氨基酸一致性为92.3%-99.1%;全基因一致性为96.0%-99.6%。pPCV2-2GD-zq质粒转染PK-15细胞后,其通过间接免疫荧光实验(IFA)能从转染细胞及其传代细胞中,检测到拯救出的病毒。【结论】分离了一株PCV2广东株GD-zq,成功构建了PCV2 GD-zq株的感染性克隆。     

副溶血弧菌CHY5-M1M噬菌体的分离鉴定及生物学特性分析

副溶血弧菌引起的疾病给水产养殖行业带来巨大损失,而随着抗生素的禁用,人们开始探索治疗水产动物病菌的新型方法,如噬菌体治疗法。从青岛市城阳水产品批发市场采集了15份海产品养殖水及下水道污水样品,以副溶血弧菌作为宿主菌,采用点滴法分离纯化获得12株副溶血弧菌噬菌体,通过双层平板法研究副溶血弧菌噬菌体CHY5-M1M的最佳感染复数、一步生长曲线、温度和pH的稳定性以及对紫外线的敏感度等生物学特性。结果显示,CHY5-M1M噬菌体效价为8.65×10¹³CFU·mL^-1,且在100感染复数时效价最高;一步生长曲线的潜伏期为20 min,裂解时长100 min,140min后达到平稳期;噬菌体在温度为40℃时效价最高,高于60℃时活性开始下降;噬菌体pH适应范围为5～11;噬菌体浓度随紫外照射时间增加明显下降;噬菌体基因组共43 193 bp,包含44个基因,无毒力因子基因和抗生素耐药基因。研究结果表明,噬菌体CHY5-M1M在开发新型抗弧菌药物、预防治疗严重海水动物弧菌病等方面具有良好的应用前景,有望作为未来的抗生素替代产品。     

红纹黄单胞菌a-氨基酸酯水解酶的克隆、序列分析及热稳定性提高

【目的】克隆红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶基因全序列,对序列进行生物信息学分析,并提高酶的热稳定性。【方法】利用多聚酶链式反应(PCR)克隆α-氨基酸酯水解酶基因全序列;应用生物信息学软件对获得的基因序列及编码的蛋白序列进行分析;通过同源建模,预测红纹黄单胞菌α-氨基酸酯水解酶的三维结构;通过定点突变替换氨基酸序列中高度柔性的位点,提高该酶的热稳定性。【结果】从红纹黄单胞菌(Xanthomonas rubrillineans)中扩增得到α-氨基酸酯水解酶基因aeh(GenBank登录号JF744990),核苷酸序列长度1 917 bp,编码638个氨基酸。序列比对和同源性分析显示,该酶与白纹黄单胞菌Xanthomonas albilineans str.GPE PC73的肽酶及地毯草黄单胞菌Xanthomonas axono-podis pv. citri str. 306的戊二酰-7-氨基头孢烷酸酰化酶氨基酸序列相似性最高,分别为91%和83%,系统进化分析表明,该酶与白纹黄单胞菌Xanthomonas albilineans str. GPEPC73的肽酶亲缘性最高。基于预测的三维模型,对高度柔性的位点进行饱和突变,从282株突变体中筛选得到3株T50较野生型高5°C以上的突变体。【结论】对红纹黄单胞菌AEH的氨基酸序列分析有助于探索同源蛋白的进化过程。对高度柔性位点进行饱和突变的策略可以用于提高热稳定性。     

PRRSV-PCV2重组病毒的构建及PRRSV转录调控机制研究

目的 本研究旨在探讨猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)感染性cDNA克隆作为猪圆环病毒(PCV2)的主要免疫原开放阅读框架2(ORF2)表达载体的可行性,以及利用重组病毒对PRRSV复制转录过程进行解剖.方法 以北美株PRRSV感染性克隆pAPRRS为平台进行反向遗传操作,分别在pAPRRS的ORF1和ORF2间,ORF5和ORF6间,ORF6和ORF7间插入PCV2 ORF2,且对拯救病毒vPCV进行了病毒学及分子生物学鉴定.结果 vPCV的sgmRNA2.1利用了PRRSV mRNA2的转录调控序列(TRS),形成由PRRSV GP2和PCV2衣壳蛋白组成的sgmRNA2.1.外源基因的插入同时也导致重组病毒启用新的TRS 而产生3条新亚基因组,其中sgmRNA2.2和sgmRNA2.3采用PCV2上的序列来取代PRRSV RNA2本身的TRS;另一条sgmRNA2.4则为非经典型亚基因组,其TRS在PRRSV相应的AUG下游.结论 2株PRRSV-PCV2重组病毒可以稳定传代,为进一步研发PRRSV遗传标疫苗奠定了基础;插入片段上一些类似TRS序列的引入及插入片段(718bp)过长导致PRRSV ORF2 TRS 本身和其两翼序列的RNA结构变化是引起重组病毒遗传不稳定性的最主要原因;PRRSV可以利用TRS样外源序列作为转录启动子,这为进一步解剖PRRSV复制转录过程奠定了基础.     

对未知关系个体进行系谱推断的自动分析系统

基于短串联重复序列(short tandem repeat, STR)和单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)的亲缘关系推断在群体遗传学、法医学等领域应用广泛,但目前没有成熟的系统可以实现针对STR数据和SNP数据的自动批量化处理。为弥补这一空白,项目组开发了一款基于STR数据和SNP数据的DNA系谱推断系统(DNA Genealogy Analyzer Version 1.0, DGA v1.0),该系统可运用STR和SNP亲缘关系预测算法计算未知亲缘关系群体中的所有亲缘关系。系统核心算法部分基于Python语言实现,前端部分采用HTML和CSS语言编写,整体采用Python的Flask框架开发。该系统与已有分析方法相比,结果一致性为100%,运算效率提高了800%以上,在群体遗传学等领域有重要应用价值。     

两株对虾幼体弧菌病病原的分离和鉴定

从患弧菌病的凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）幼体中分离到两株病原菌zouA和zouB,常规形态和生理生化试验表明均为弧菌属菌种,弧菌编码鉴定系统分别鉴定为溶藻弧菌（Vibrioatginolyticus）和副溶血弧菌（V.parahaemolyticus）。副溶血弧菌R72H序列检测结果进一步证实菌株zouB为副溶血弧菌。对菌株zouA的16S rRNA基因序列分析表明该菌株与溶藻弧菌、副溶血弧菌等弧菌的相似性均高于98％,相互间不能区分;HSP60基因序列分析表明该菌株与溶藻弧菌相似性达98％以上,而与所有其它弧菌的相似性不到92％。结合表型和分子特征的鉴定结果,菌株zouA和zouB分别被鉴定为溶藻弧菌和副溶血弧菌。     

副溶血性弧菌重复序列-PCR分型研究

利用基因外重复回文序列-PCR(REP-PCR)和肠细菌基因间共有重复序列-PCR(ERIC-PCR)技术,对副溶血性弧菌进行了分子分型研究和亲缘关系的探讨,并使用Hunter和Gaston方法计算分辨力指数.结果显示40株副溶血性弧茵分离株均可扩增产生可重复的DNA指纹图谱,并且不同菌株基因组DNA的扩增条带具有多态性.根据SPSS10.0软件得出的树状图结果,REP-PCR可以把40株茵分为21个型,分辨力指数可达到0.953,优势菌型为G1型;ERIC-PCR可将40株菌分成4个型,分辨力指数为0.5.研究显示重复序列-PCR方法可以用于该菌分型分析,REP-PCR具有较好的分型能力.在两种PCR的DNA指纹图谱中,血清型O1群与O3群主条带均非常相似,表明它们之间亲缘关系密切.     

活血丹小尺度空间遗传结构

活血丹(Glechoma lonituba)是唇形科活血丹属的多年生克隆草本植物。采用简单重复序列区(ISSR)分子标记技术,比较分析了3个不同斑块活血丹的遗传多样性、克隆多样性以及小尺度空间遗传结构,并探讨其与生境异质性、繁殖体传播和人为干扰的相关性。结果表明:1)活血丹物种水平的遗传多样性很低,各斑块的遗传多样性较低,以水渠边斑块最高,平葛村斑块次之,竹林下斑块最低。2)活血丹物种水平的克隆多样性较高,各斑块活血丹的克隆多样性以水渠边斑块最大,平葛村斑块次之,竹林下斑块最低。3)遗传分化系数Gst为0.7129,表明活血丹的遗传变异大部分存在于斑块间;斑块间的基因流较小,仅为0.2004。4)空间自相关分析表明活血丹一定的空间距离下存在显著的空间遗传结构,竹林下斑块在100cm时存在显著性正相关,其X轴截矩为205.994cm;平葛村斑块在200cm时存在显著性正相关,其X轴截矩为235.388cm;水渠边斑块在150cm时存在显著性正相关,其X轴截矩为240.336cm。应用软件SPAGeDi 1.2软件对各斑块的空间遗传结构进行量化,表明平葛村斑块具有最强的空间遗传结构,水渠边和竹林下斑块的空间遗传结构较弱。活血丹的遗传结构、克隆结构及空间分布格局受到其繁殖体传播特征、人为干扰和繁殖权衡的影响,是其对生境异质性的适应结果。     

葡萄果粒表皮酵母菌多样性研究

从新疆、甘肃、陕西、宁夏、山东主要酿酒葡萄产区收集葡萄果粒并分离得到酵母258株,利用26S rDNA的D1/D2区序列分析并结合形态学、生理学特征对这些菌株进行了分类学研究,探讨了这些地区葡萄果粒表皮酵母的物种多样性及其分布.共鉴定出13属26种,其中优势属为汉逊酵母属Hanseniaspora(5种),假丝酵母属Candida(4种),毕赤酵母属Pichia(4种)和伊萨酵母属Issatchenkia(2种).对分离自不同地域的同种内不同菌株进行了D1/D2序列分析比较,以探讨不同地理起源地酵母种内序列稳定性及其变异.     

七种我国昆虫病原线虫共生菌的分离与鉴定

昆虫病原线虫共生菌是一类具有广阔发展前景的生物防治资源,由于这类菌的分类鉴定工作起步晚,存在分类混乱和不系统的现象,在本土资源十分丰富的我国尤为突出.本文对本实验室分离的7个共生菌菌株进行了分类描述,建立了以生理形态,生化特征为分类基础,结合16 SrDNA序列分析的有效鉴定方法.