应用RACE法克隆鸽恒定链基因的研究

为比较禽类恒定链的结构和功能, 应用RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) 技术首次克隆并鉴定了鸽恒定链基因。首先用一对含高度保守的DNA片段的简并引物, 从鸽脾细胞RNA扩增部分恒定链片段, 接着测序并设计新引物分别从5′和3′RACE扩增延长该片段。最后根据全基因的序列设计上、下游引物,获得大小为1 050 bp的全长cDNA。比较核苷酸序列, 鸽与鸡的Ii链同源性达到82.8％, 而与人等其它动物的同源性则在52.0％以上; 其中633 bp的开放阅读框编码211个氨基酸残基的前体蛋白。推导和分析氨基酸序列表明, 分子结构与鸡恒定链相似, 其中有些氨基酸残基表现出较高的保守性。     

一株拮抗真菌的蛇足石杉内生细菌分离鉴定及培养条件优化

从蛇足石杉(Huperzia serrata)叶片中分离到一株对小麦赤霉(Fusarium graminearum)等多种植物病原真菌有强拮抗作用的内生细菌 H-6.通过形态和培养特性观察、生理生化实验及 16S rDNA 序列分析,初步鉴定该茵属于伯克霍尔德属,命名为 Burkholderia sp.H-6.同时还对该菌培养条件进行了优化,得出马铃薯浸出液中添加 2.5%的甘露醇和 0.1% NaNO3 有利于细胞生长和抑菌活性的产生,最适培养温度为 28℃.最佳初始 pH4.0.     

I型鸭肝炎病毒VP1、3D基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

根据GenBank中的I型鸭肝炎病毒全基因序列设计了扩增I型鸭肝炎病毒VP1、3D基因的引物, 用该特异性表达引物从I型鸭肝炎病毒cDNA模板中扩增得到目的基因VP1、3D, 用相同的限制性内切酶酶切目的基因和表达载体pET32a后构建重组表达载体, 转化宿主BL21(DE3), 用不同浓度的IPTG诱导VP1、3D基因的表达, 收集菌液进行SDS-PAGE电泳, Western-blotting分析蛋白免疫原性。结果表明, VP1、3D在大肠杆菌中表达量较高, 表达产物的分子量约为48 kD、68 kD, 并能被兔抗DHV-1血清所识别。I型鸭肝炎病毒VP1、3D蛋白在大肠杆菌中表达产物具有免疫原性。     

青鳉prdm14的原核表达、多克隆抗体制备及其应用

青鳉(Oryzias latipes)是研究遗传发育和细胞多能性的重要模式鱼类, 为探究prdm14同源基因的潜在作用, 实验将青鳉prmd14经原核表达后制备了兔抗Prdm14多克隆抗体。首先, 将prdm14基因的部分编码区连接到pET32a质粒中, 构建重组表达载体pET32a-prdm14?600。随后将重组载体转化至大肠杆菌(Escherichia coli)Rosetta(DE3), 经异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-d-thiogalactoside, IPTG)诱导表达, 获得分子量为60 kD的Prdm14重组蛋白。接着大量诱导蛋白表达并切胶纯化, 免疫家兔(Oryctolagus cuniculus), 6周后获得阳性抗体, 最后通过ELISA和Western blot检测抗体效价及其特异性。结果显示, 在37℃、0.6 mmol/L IPTG、诱导3h的条件下, 可获得Prdm14重组蛋白的高效表达; 制备的兔抗青鳉Prdm14多克隆抗体能够特异性识别青鳉组织中表达的Prdm14蛋白以及在HepG2细胞中过表达的青鳉Prdm14: EGFP融合蛋白。综上所述, 研究首次制备了一种能有效识别青鳉Prdm14的多克隆抗体, 该抗体的获得为后续研究prdm14基因在鱼类多能性干细胞中的作用提供了有力工具。     

家蚕传染性软化病病毒（桐乡株）VP1基因片段的克隆及序列分析

以首株在中国分离到的家蚕传染性软化病病毒（Bombyx mori infectious flacherie virus,BmIFV）BmIFV-CHN001基因组为模板,扩增了编码主要结构蛋白的VP1基因。克隆测序后得到VP1基因片段906 bp。该序列与已发表的日本毒株相比,核苷酸序列的相似性为99.3%,编码氨基酸的相似性为100%,证明该毒株与家蚕传染性软化病病毒日本株的同源性较高。把BmIFV-CHN001的VP1序列与同属的另外6个昆虫小RNA病毒的结构蛋白进行序列比对,构建系统发育树,对其进化关系进行了初步分析,结果显示这7种病毒具有相近的亲缘关系,而BmIFV-CHN001与蜜蜂囊雏病毒的亲缘关系最近。     

凡纳滨对虾细菌性病原的分离鉴定和耐药性研究

从5批患病的凡纳滨对虾分离细菌性病原,共分离纯化了50株细菌,随机选择形态差异的11株进行16S rDNA基因测序。测序结果表明,这11株菌主要分布在节杆菌属、弧菌属、芽胞杆菌属、微小杆菌属和希瓦氏菌属。对其中2株弧菌进行16S rDNA基因系统进化树分析,发现1株A1-1可能为Vibrio parahaemolyticus(副溶血性弧菌),而另外1株菌A2-3可能为Vibrio rotiferianus(半滑舌鳎病原菌轮虫弧菌)。形态和生理生化鉴定表明A1-1符合副溶血性弧菌的基本特征,可能是副溶血性弧菌中的一个型。人工感染实验表明A1-1对金鲫鱼具有明显的致病性,1×10~6 CFU感染剂量时能使80%金鲫鱼死亡。耐药性分析表明A1-1对土霉素、红霉素有较强的抗药性,而对链霉素、新霉素、四环素和氟本尼考均表现一定的敏感性。     

桑蚕金属硫蛋白基因在大肠杆菌中的克隆和表达

用\%Bam\%HⅠ和\%Sac\%Ⅰ双酶切质粒pCM1\|1,获得酵母的MTI基因片段,用非放射性地高辛标记作为探针。提取桑蚕肥苏蚕卵的总DNA,分别用\%Eco\%RⅠ、\%Bam\%HⅠ和\%Hin\%dⅢ酶切,与MTI探针进行Southern杂交,出现较强的杂交信号。然后用\%Eco\%RⅠ完全酶切桑吞的总DNA,电洗脱法回收1～6kb的染色体片断,与\%Eco\%RⅠ酶切的M13-载体以3∶1比例连接,转化受体菌DH5α。筛选到4 000多个白色转化子,与探针MTI进行Southern杂交筛选阳性转化子,选择到有强杂交信号的三个转化子［编号为T1(pZHC\|1)\,T5(pZHC\|5)\,T7(pZHC\|7)\]。用12种限制性内切酶对pZHC\|5重组质粒进行酶切分析表明插入片段约12kb,在基因内有一个\%Hin\%dⅢ位点。抗性测定表明受体菌DH5α在含有50mmol/L CuSO\-4的培养基上生长,在含有52mmol/L CuSO\-4的培养基上不生长,而转化子确能在含有52mmol/L CuSO\-4以上的培养基上生长。上述研究结果表明12kb左右的插入片段含有桑吞的金属硫蛋白基因。     

冷泉港生物科技股份有限公司

冷泉港生物科技股份有限公司成立于上世纪 80年代 ,总部设在台湾。经过 2 0多年的发展 ,它已经成为一家专业的生命科学仪器代理公司 ,其代理的产品可以分为 5个部分 :微生物学仪器、分子生物学仪器、蛋白质组学仪器、生物芯片仪器和常规仪器。在这五部分科研仪器中 ,大部分是高     

青鱼生长激素的重组表达及其多克隆抗体的制备

以含有的青鱼生长激素编码区cDNA的重组质粒pbcGHc为模板,高保真PCR扩增青鱼生长激素（GH）成熟肽cDNA序列,定向插入原核表达载体pET-28a,构建青鱼GH原核表达质粒pET-bcGH。将pET-bcGH转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导青鱼GH基因在大肠杆菌中的融合表达,SDS-PAGE凝胶电泳结果显示一条23 kDa的诱导表达重组青鱼GH带。以草鱼GH多克隆抗体为一抗,Western Blot证明,该重组青鱼GH具有免疫学活性。将经过亲和层析、透析纯化后的重组青鱼GH作为抗原,采用改进的方法对家兔进行皮下免疫注射,获得青鱼GH多克隆抗血清。以该多抗为一抗,Western Blot 可以检测出4 ng的抗原量;并且在青鱼垂体组织抽提液中和血清中检测到一种能与该抗血清作用的大小为21 kDa的蛋白质。这些结果表明本研究得到的青鱼GH多克隆抗血清具有较好的免疫特性。     

大鼠Y染色体探针的制备与鉴定

目的:研究制备地高辛标记的大鼠性别决定基因Y区(Y染色体,SRY)探针,用于检测雄性大鼠来源的细胞在雌性受鼠体内的SRY基因表达情况.方法:按已知的雄性大鼠Y染色体上性别决定基因(SRY)的序列,请上海博亚公司合成oligoDNA,采用PCR技术连接并扩增,地高辛标记的方法制备基因探针.以雌性大鼠为对照,原位杂交法检测大鼠肾组织切片Y染色体阳性细胞情况.结果:用原位杂交法证实在雄性大鼠肾脏内有SRY表达,而雌性大鼠肾脏无Y染色体阳性细胞,证实这种探针具有较高的敏感性和特异性.结论:大鼠性别决定基因SRY探针的制备成功,为进一步研究异体雄性大鼠细胞移植后的分布和表达提供了实验基础.