皖南尖吻蝮蛇中11个C型凝集素类似蛋白亚单位的cDNA克隆和序列分析

通过放射性标记DNA探针筛选和PCR克隆筛选 ,从皖南尖吻蝮蛇毒腺的λgt11cDNA文库中 ,克隆得到了 11个编码C型凝集素类似蛋白亚单位的cDNA .其中 2个克隆分别含有编码an tithrombinA的A链和B链的序列 .另外 6个则含有编码如下肽链的序列 :antithrombinC的A链和B链、agkisacutacin的A链和B链、抗凝血因素的A链和B链 ,其它 3个克隆含有编码未知蛋白质的序列 .有趣的是 ,在编码AntithrombinC的序列中 ,每条链中除了含有 7个与所有C型凝集素类似蛋白位置一致的Cys外 ,在B链上还含有一个额外的Cys3;2条B链上的Cys3可能形成一对新的链间二硫键 .氨基酸序列的比较及进化分析显示 ,C型凝集素类似蛋白B链起源于一个单系类群 ,A链至少有 4个进化起源     

家蝇卵黄蛋白基因的克隆与结构序列分析

家蝇卵黄蛋白基因编码的卵黄蛋白是家蝇胚胎发育的重要营养来源 .根据 3种家蝇卵黄蛋白cDNA保守序列设计引物 ,用PCR技术从家蝇基因组DNA中扩增到大小为 76 8bp的mdYP1基因的部分DNA片段 .经地高辛标记成特异性探针 ,从构建的家蝇基因组文库中筛选出一个阳性克隆 ,并从该克隆中分离到大小为 3991bp的mdYP1基因组基因 .序列分析显示 ,该基因组序列含有约1 6kb的 5′ 上游区和 1 0kb的 3′ 下游区 ,编码区由一个 6 1bp的内含子和大小分别为 2 2 2bp和10 2 8bp的 2个外显子组成 .5′ 上游区含有典型的CAAT TATA盒 .     

cDNA末端快速扩增技术(RACE)的优化与改良

cDNA末端的快速扩增(RACE)法是延伸已知部分外显子序列和克隆全长cDNA基因的主要方法之一。广泛用于许多已知功能基因片段的进一步延伸和全长cDNA的克隆。但由于其过程复杂、涉及多步连续的酶促过程,如反转录、TdT加尾、第二链合成、RACE-PCR扩增及RACE产物克隆等,在实际应用中有许多问题和相当难度,主要针对RACE各步骤中存在的问题进行了分析,并对其优化和改良进行了综述。     

产气荚膜梭菌α毒素基因的克隆及结构分析

应用PCR技术,从产气荚膜梭菌菌株NCTC64609中,扩增出A型产气荚膜梭菌α毒素基因C端片段(cpa408),并将其克隆至pMDl8-T载体中．经转化,α互补蓝白菌落选择培养,提取质粒,进行PCR和Eco RⅠ、PstⅠ双酶切鉴定,筛选出阳性重组克隆．经核苷酸序列分析证实,cpa408基因阅读开放框架由372个核苷酸组成,编码124个氨基酸．经计算机分析,cpa408基因序列与国外文献报道的A型产气荚膜梭菌α毒素基因C端片段同源性达99％以上,表明所克隆的基因即为α毒素基因C端片段．     

A型产气荚膜梭菌α毒素全基因的分子克隆与核苷酸序列分析

应用PCR技术,从A型产气荚膜梭菌菌株NCTC64609中扩增出A型产气荚膜梭菌α毒素全基因(cpa 1229基因)并将其克隆至pMDl8-T载体中。经转化、IPTG／X—gal选择培养,提取质粒,PCR和EcoRI／Pstl双酶切鉴定,筛选阳性重组克隆。经核苷酸序列分析证实,cpa1229基因阅读开放框架由1194bp组成。经GenBank检索对照分析,cap1229基因序列与国外献报道同源性达98．3％,表明本实验所克隆的cpa1229基因即为A型产气荚膜梭菌α毒素基因。     

鼠伤寒沙门氏菌asd基因的克隆及序列分析

以鼠伤寒沙门氏茵标准株基因组DNA作为模板,用PCR的方法扩增鼠伤寒沙门氏菌的asd基因并克隆入质粒pUCl9,并对其进行测序,序列与献报道一致。同时将质粒pYA248上的链球菌asd基因进行了置换,观察了分别含有链球菌asd基因与鼠伤寒沙门氏菌asd基因的质粒在减毒鼠伤寒沙门氏菌X4072中的生长情况,结果表明含有鼠伤寒沙门氏菌的asd基因的高拷贝质粒pUCl9的菌株生长情况更好。为完善染色体／质粒平衡致死系统,构建减毒鼠伤寒沙门氏活菌疫苗奠定了基础。     

代表活性污泥中苯酚降解菌群的ERIC-PCR产物片段的多态性

对可能代表活性污泥中两个时期的主要苯酚降解菌群的：ERIC-PCR指纹图谱中的两条2．1kb的条带(P1和P8)中的DNA片段进行克隆、转化,得到193个转化子。．HinfⅠ物理图谱分析得到35种酶切类型,将两端各进行1次测序后,同源性大于90％的克隆归为一类,共得到10种序列类型。对各类型的代表克隆进行了全长测序,5种类型为P1条带所有,3种类型为P8所有,二者共享的类型为2种,丰度最高的片段为S3,P1条带中76．3％的转化子和P8条带中66．7％转化子属该类型。对所得序列进行检索分析,它们与GenBank中已知基因序列均无显著同源性。用S3特异性引物对活性污泥样品及其它在LB、dCGY、MP和FWM培养基上的回收菌进：行扩增,除LB上的回收菌没有显示目的条带外,活性污泥和其回收菌中均检测到带有该基因组片段的菌种的存在。研究为专一性分离降酚活性污泥中的优势菌提供了分子探针。     

中国长白山乌苏里蝮蛇金属蛋白酶解整合蛋白Ussurin基因克隆和序列分析

采用Clontech链转换建库试剂盒,建立了中国长白山乌苏里蝮蛇毒腺cDNA文库,从中克隆了金属蛋白酶/解整合蛋白Ussurin,并进行了序列分析。结果显示,Ussurin开框读码序列由1434bp组成,编码478个氨基酸。由核苷酸顺序推导的氨基酸序列可以看出,Ussurin最初的翻译产物是酶原前体;依次含有18氨基酸组成的信号肽,171氨基酸组成的酶原区和由289氨基酸组成的Ussurin（200氨基酸组成的金属蛋白酶结构域、16氨基酸组成的间隔区和73氨基酸组成的解整合蛋白结构域）。Ussurin的金属蛋白酶结构域含有3对二硫键;解整合蛋白结构域含有6对二硫键和特征性RGD(精氨酸甘氨酸天冬氨酸)结构。其基因序列和结构域组成与GenBank中蛇毒金属蛋白酶/解整合蛋白呈现高度同源性属于P-Ⅱ。氨基酸序列blast比对发现,酶原区和解整链蛋白结构域呈现极高的同源性,而金属蛋白酶结构域却出现了极高的变异,推测这些变异结构区是为了适应不同的底物、不同受体或同一受体的不同结构域。     

野猪及其与家猪杂种猪Myostatin基因3'编码区的克隆和序列分析

Myostatin, which is a highly conservative gene among breeds, is a negative regulator of muscle. The 3' coding region of wild boar and crossbred pig myostatin was cloned by RT - PCR and sequenced. Compared with that of GenBank, the homology of the nucleotide sequence between wild bear and crossbred pig is identical in this region indicating that domestic pigs were evolved from wild boar and there was not changed in this region during the evolution processes.     

果蝇中Ecp蛋白的表达、纯化与抗体制备

获得特异性抗Ecp多克隆抗体,为进一步研究ecp的功能奠定基础。利用特异引物,通过RT-PCR扩增出编码Ecp蛋白的全长cDNA,克隆至谷胱甘肽S转移酶融合蛋白表达载体pGEX-4T-1(His)6C中,转染大肠杆菌DH 5α,经诱导表达后,利用谷胱甘肽琼脂糖珠从细胞裂解物中特异吸附融合蛋白,经凝血酶裂解,释放出Ecp蛋白,再经Ni-NTA亲和层析,最终获得高纯度的Ecp蛋白。用纯化的Ecp蛋白免疫新西兰家兔,亲和层析纯化抗Ecp抗体。利用该抗体进行的Western Blot结果表明：Ecp蛋白在野生型黑腹果蝇胚胎、三龄幼虫神经系统、成虫、成虫头部组织中均有明显表达,提示ecp可能是一个重要的管家基因。