小麦TaWRKYⅢ-A37和TaWRKYⅡc-D2基因的克隆与表达分析

为了探究小麦(Triticum aestivum L.)WRKY基因的功能,采用同源克隆的方法,从小麦品种‘科农199’中克隆得到2个WRKY基因,分别命名为TaWRKYⅢ-A37和TaWRKYⅡc-D2,并对其进行生物信息学分析和不同逆境胁迫下的表达分析。生物信息学分析显示,TaWRKYⅢ-A37和TaWRKYⅡc-D2基因都含有2个内含子和3个外显子,分别编码206和138个氨基酸,编码蛋白都属于亲水性不稳定非分泌型的核蛋白。系统进化分析表明,TaWRKYⅢ-A37蛋白与其两个同源拷贝的亲缘关系最近,而TaWRKYⅡc-D2蛋白与粗山羊草亲缘关系最近。qRT-PCR结果表明,TaWRKYⅢ-A37和TaWRKYⅡc-D2基因在小麦根、茎和叶中均有表达,前者在根中表达量最高,后者在叶中表达量最高,二者均在茎中低表达;在苗期TaWRKYⅢ-A37基因受到PEG、H_2O_2和ABA胁迫后表达上调,NaCl处理后4～8 h内表达下调且低于对照表达水平,而且在灌浆期受到PEG、NaCl、H_2O_2和ABA胁迫后表达均上调;苗期TaWRKYⅡc-D2基因在NaCl、H_2O_2和ABA胁迫后表达下调,PEG处理2 h时表达上调且高于对照表达水平,并且在灌浆期经PEG和NaCl胁迫后表达下调,受H_2O_2和ABA胁迫后表达上调。该研究结果为深入探究TaWRKYⅢ-A37和TaWRKYⅡc-D2基因的抗逆功能奠定了理论基础。     

地涌金莲MlCCD8b基因的克隆与表达分析

该研究以地涌金莲(黄色苞片型YN01和红色苞片型RD05)为材料,采用RACE技术克隆获得地涌金莲CCD8b基因的cDNA全长,进行氨基酸序列比对及系统进化树构建,并采用实时荧光定量PCR技术检测MlCCD8b基因在不同地涌金莲类型和不同组织中的表达模式。结果表明：(1)序列分析显示,MlCCD8b的ORF全长1 671 bp,编码556个氨基酸,存在1个类胡萝卜素加氧酶家族的典型保守结构域RPE65,推测其相对分子量为61 574.26 Da,等电点6.61,亚细胞定位于叶绿体基质中的类囊体上,所编码的MlCCD8b蛋白为亲水性蛋白。(2)同源对比分析及构建系统进化树发现,地涌金莲MlCCD8b蛋白与小果野蕉亚种、凤梨等单子叶植物的CCD8b蛋白遗传关系最近。(3)荧光定量PCR检测结果表明,MlCCD8b在吸芽数量多的黄色苞片型YN01的所有组织中均有表达,而在吸芽数量少的红色苞片型RD05中,其苞片内未能检测到MlCCD8b的表达,但其他组织中皆有表达;MlCCD8b在2种类型地涌金莲中呈现一致的组织表达特异性,即在花序轴中的表达量最高,其次是吸芽芽点、根尖和叶片,在苞片中的表达量最低或不表达。(4)2种类型地涌金莲同一组织部位比较结果显示,RD05的花序轴、吸芽芽点、根尖和叶片中的MlCCD8b相对表达量分别是YN01的4.47、4.67、2.09和1.10倍。(5)利用高效液相色谱 串联质谱法测得RD05根尖部位的5 脱氧独脚金醇含量是YN01的15.57倍,与MlCCD8b在根尖的表达趋势一致。研究认为,MlCCD8b基因可能通过调控独角金内酯的合成,促进或抑制地涌金莲吸芽的萌生。该研究结果可为MlCCD8b基因的生物学功能研究提供依据,并为今后通过分子辅助育种调控MlCCD8b的表达,从而控制地涌金莲吸芽数量提供理论支持。     

石灰碳铵熏蒸联合生物有机肥对香蕉枯萎病和细菌群落的影响

以连续种植的香蕉枯萎病高发病蕉园为试验点,通过实时定量PCR和高通量测序等方法,研究了田间条件下石灰碳铵熏蒸联合生物有机肥施用对香蕉枯萎病的防治效果,以及对土壤细菌群落结构和组成的影响。结果表明: 与不熏蒸施用有机肥(OF)相比,香蕉枯萎病发病率在施用有机肥前使用石灰碳铵进行熏蒸处理(LAOF)和施用生物有机肥前使用石灰碳铵进行熏蒸处理(LABF)中分别降低了13.3%和21.7%,病原菌的拷贝数分别降低了22.4%和33.0%。与OF处理相比,石灰碳铵熏蒸联合不同肥料施用均显著降低了细菌的丰富度和多样性,形成了明显不同的群落结构,且熏蒸对群落组成的差异产生了决定性的影响。LABF的细菌丰富度和多样性均低于其他处理,群落组成也与其他处理存在明显差异。与OF处理相比,熏蒸处理(LAOF和LABF)显著增加了土壤中水恒杆菌、布鲁式菌和漯河杆菌属的相对丰度,且在LABF中的相对丰度均高于LAOF,水恒杆菌和布鲁式菌的相对丰度差异显著。在田间条件下,施用生物有机肥之前使用石灰碳铵进行熏蒸处理能够显著降低病原菌数量,改变土壤细菌群落结构,激发土壤有益微生物,从而减少香蕉枯萎病的发生。     

轻度支气管哮喘儿童的诱导痰菌群特征

目的探讨轻度支气管哮喘儿童的诱导痰菌群特征及临床意义。方法纳入年龄为6~12周岁于2018年11月至2019年1月在深圳市儿童医院呼吸科门诊定期复诊的轻度支气管哮喘患儿51例(哮喘组),留取诱导痰,匹配同年龄段97例健康无过敏儿童的口咽拭子作为对照。诱导痰及口咽拭子提取总DNA并扩增,对16S rRNA基因进行高通量测序并对测序结果进行生物信息学分析。结果NMDS分析结果显示哮喘组与健康对照组研究对象菌群结构存在差异;哮喘组的诱导痰菌群多样性指数(Shannon index)高于健康对照组(2.34±0.53 vs 1.87±0.50,P<0.05)。门水平分析显示,哮喘组与健康对照组的菌群均主要为厚壁菌门(38.34%vs 44.74%,P<0.05)、变形杆菌门(31.14%vs 19.78%,P<0.05)、拟杆菌门(14.59%vs 20.52%,P<0.05)、放线菌门(10.41%vs 7.85%,P<0.05)和梭杆菌门(2.82%vs 6.67%,P<0.05),但两组之间的构成比有明显差异。与健康对照组相比,在属水平上哮喘组韦荣球菌属(5.27%vs 8.96%)、普雷沃菌属(8.38%vs 17.35%)、罗斯菌属(1.50%vs 5.46%)、纤毛菌属(1.37%vs 4.39%)等非条件致病菌属比例明显下降(均P<0.05),而嗜血杆菌属(9.83%vs 6.17%)、卟啉单胞菌属(2.48%vs 1.41%)、莫拉菌属(5.66%vs 0.42%)、诺卡菌属(3.40%vs 0.00%)等条件致病菌属比例明显上升(均P<0.05)。结论尽管轻度支气管哮喘患儿已临床控制,但诱导痰内菌群仍存在结构紊乱。气道菌群紊乱可能是儿童支气管哮喘的发病机制之一。除了致病菌属外,非致病菌菌属的构成变化可能也是儿童哮喘的一个发生机制。     

基于分级过滤的自然水体原核微生物群落分析

自然水体中微生物种类丰富,采集了上海周边的湖水、河水、海(岸)水、井水四类水体各两处样品,设计了含0.1μm终端截留孔径的半自动分级过滤装置分离富集不同粒径的水体微生物,使用原核微生物通用引物对16S rRNA基因V3+V4区扩增,高通量测序获得序列,对四类水体中的微生物群落进行比较分析,关注了能穿透0.22μm常规除菌过滤孔径的超微小微生物。结果显示水体环境主导了微生物的群落差异,河水与湖水中的群落总体接近,不同于海(岸)水和井水;海(岸)水和井水的微生物群落差异较大。0.1μm上截留的优势超微小微生物在河水与湖水样品中均为Proteobacteria门SAR11 clade目的Clade Ⅲ和Actinobacteria门Sporichthyaceae科HgcI clade,海(岸)水中为Proteobacteria门SAR11 clade目的Clade Ia和Nanoarchaeota门Woesearchaeia古菌,井水中为Nanoarchaeota门Woesearchaeia属古菌以及未定域或未分类的微生物。其中未定域的微生物16S rRNA基因在系统发育树上单独成簇,可能是古菌的一个新类型。本研究所使用的分级过滤装置显示了在发掘超微小微生物上的潜力。     

基于焦磷酸测序技术建立基因编辑水稻检测方法

基因编辑技术发展迅速,但对应的检测方法较少。为寻找创建基因编辑作物适用的检测方法,以 PL3 基因编辑水稻编辑位点为靶标,有效设计了焦磷酸测序的扩增引物及测序引物,并进行有效性检测,分别利用Sequence to Analyze等程序以及SNP和AQ两种模式完成了对PL3 基因的定性和定量检测试验,建立了 PL3 基因编辑水稻编辑位点焦磷酸测序检测方法。结果表明,基于焦磷酸测序技术可以通过检测编辑位点从而将基因编辑型水稻与野生型水稻进行区分。与常规的转基因检测方法相比,该检测方法具有较好的准确性、高效性及高灵敏度等优点,在基因编辑型水稻编辑位点定性和定量检测分析方面具有很好的应用前景。     

一株稀有海洋真菌Stachybotrys longispora FG216的De Novo测序及基因组学分析

【背景】长孢葡萄穗霉菌(Stachybotrys longispora) FG216是一株稀有海洋真菌,其次生代谢产物FGFC1具有纤溶活性。进行S. longispora FG216的基因组序列分析,将充实和促进海洋微生物功能基因和次生代谢产物合成生物学的基础研究和应用研究。【目的】解析S. longispora FG216的基因组序列,分析基因组生物功能和同源相似性关系,分析次生代谢产物纤溶活性化合物FGFC1的相关基因。【方法】基于Illumina HiSeq高通量测序平台对S. longispora FG216菌株进行De Novo测序,使用SSPACE、Augustus等软件进行组装、编码基因预测、基因功能注释、物种共线性分析以及预测FGFC1次生代谢产物合成基因簇。【结果】S. longispora FG216的基因组测序总长度为45622830bp,共得到605个Scaffold,GC含量为51.31%,注释预测得到13329个编码基因和169个非编码RNA。基因组测序数据提交至国家微生物科学数据中心(编号为NMDC60016264),其中13 053、8 422、8 460、7 714和2 847个基因分别能够在NR、KEGG、KOG、GO和CAZy数据库匹配到注释信息。比较基因组学分析发现,Stachybotrys具有保守性,核心基因占基因家族总数目的71.44%,S. longispora FG216与S. chlorohalonata IBT 40285的相似性最高;同时,预测得到101个次生代谢产物合成基因簇,其中18个基因簇与已知的化合物相匹配。通过antiSMASH预测,Cluster57是编码合成FGFC1母核结构异吲哚啉酮的基因簇,与S.chlorohalonataIBT40285中的基因簇相似度为40%。【结论】海洋稀有真菌S.longisporaFG216的基因组信息已上传至国家微生物科学数据中心公开使用,为Stachybotrys种属的研究提供了重要的参考意义,同时发现了S. longispora FG216次生代谢产物纤溶活性化合物FGFC1母核部分编码基因是Cluster 57。     

基于高通量测序的闽楠幼林根际土壤丛枝菌根真菌群落变化

【背景】闽楠是珍贵用材树种。阐明闽楠根际土壤微生物特征,对科学经营闽楠人工林有指导作用。【目的】明确闽楠人工林恢复过程中根际土壤丛枝菌根群落随林龄的变化特征。【方法】采用高通量Illumina MiSeq测序的方法,评估不同林龄闽楠幼林根际土壤丛枝菌根真菌(Arbuscular Mycorrhiza Fungi,AMF)群落的多样性和组成,揭示造林后闽楠根际土壤真菌群落对时间序列中土壤养分变化的响应特征。【结果】从3个林龄闽楠根际土壤中共得到342 555条有效序列,共得到253个AMF-OTU,分属于1门1纲5目9科14属。α多样性指数表明,丛枝菌根真菌群落的Chao1、Shannon指数随着林龄的增加而增加,但不同林龄间差异不显著。β多样性指数表明,在闽楠幼龄阶段,不同林龄间AMF群落组成差异明显。根据Bray-Curtis相异度分析阐明AMF群落组成的相似性与林龄相关。种水平物种丰度与土壤因子的相关性分析表明,影响AMF群落丰度的主要土壤因子是pH、全钾、硝态氮和铵态氮。铵态氮与优势AMF分子虚拟种Glomus-Franke-A1-VTX00076、Glomus-Franke-A1-VTX00269的丰度呈显著正相关。【结论】随着林龄的增加,闽楠幼龄根际土壤丛枝菌根真菌的种类组成发生了显著变化,影响AMF特性的主要土壤因子是pH、全钾、硝态氮和铵态氮。这些发现将有助于揭示闽楠幼林生态系统和土壤微生物多样性的相互关系和机制,为生物多样性-生态系统功能实验提供理论依据。     

定量稳定性同位素探针技术及其在微生物生态学研究中的应用

定量稳定性同位素探针技术(qSIP)是将生态系统中微生物分类性状与代谢功能联系起来的有效工具,能够定量测定特定环境中单个微生物类群暴露于同位素示踪剂后微生物代谢活动或生长速率。qSIP技术采用定量PCR与高通量测序技术并结合稳定同位素探针技术(SIP),通过向环境样品添加标记底物进行培养,提取微生物生物标记物,利用超高速等密度梯度离心将被同位素标记的重链核酸与未被标记的轻链核酸进行分离,并对所有组分微生物类群进行绝对定量和测序分析,基于GC含量和未标记处理DNA密度曲线量化参与吸收转化的DNA同位素丰度。本文重点阐述qSIP的技术原理、数据分析流程及其在微生物生态学研究中的应用进展,并对该技术存在的问题进行了分析和展望。     

水稻长日照开花因子Lfm1的图位克隆

开花期是水稻最重要的农艺性状之一,水稻的花期决定着水稻的地区适应性和最终产量。人工选择使水稻从短日照向长日照、低纬度向高纬度扩张,因此水稻已逐渐进化出适应长日照条件下的开花调控机制。目前,虽然鉴定了一些影响水稻长日照的开花基因如SDG724、RFT1、EHD4、DTH2,但是挖掘水稻长日照开花基因还十分有限。本研究通过筛选水稻突变体库,获得一批在长日照下花期有显著差异的突变体材料,其中一份突变体lfm1(late-flowering mutant1),在长日照条件下开花延迟,在短日照条件下开花时间正常。通过图位克隆,将Lfm1基因初定位至第8染色体端粒附近。进一步的精细定位将Lfm1基因定位于分子标记8-0.269和与8-0.283之间,范围为12 kb,该区域包括3个候选基因。经测序分析发现,在突变体lfm1中,LOC_Os08g01420基因的第六外显子2800处缺失9个碱基,突变体lfm1等位于已报道的突变体ehd3。在适度(中日照条件下,~12 h/12 h)的光照条件下,突变体lfm1表现为穗粒数增多,生育期略延长,具有应用于生产的潜力。Lfm1基因的克隆为培育适应不同生态区域的水稻材料提供了重要的基因资源。