去N端信号肽的水痘-带状疱疹病毒糖蛋白E的原核可溶性表达及其免疫原性评价

水痘-带状疱疹病毒(varicella zoster virus,VZV)糖蛋白E(glycoprotein E,gE)是VZV亚单位疫苗的主要候选蛋白,但目前原核表达系统制备的gE蛋白以包涵体形式为主,可溶性差。本研究采用去除第1～30氨基酸序列的VZV gE胞外域基因,将其与原核表达载体pET32a连接,并转化至感受态细胞BL21(DE3)中。使用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropylβ-D-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,His-tag柱纯化重组gE蛋白,蛋白质印迹法(Western blot,WB)检测其特异性。用该重组gE蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)和间接免疫荧光法检测多克隆抗体效价及特异性。结果显示,BL21/pET32a-VZV gE工程菌可以表达可溶性重组gE蛋白,纯化后纯度约为90%。WB鉴定该重组蛋白具有良好的免疫反应性。ELISA检测显示小鼠抗VZV gE多克隆抗体效价＞1∶10 000,间接免疫荧光实验结果显示该抗体特异性较高。结果表明,本研究在原核表达系统中成功表达可溶性重组VZV gE蛋白,同时该蛋白具有较强的免疫原性,这为VZV gE亚单位疫苗的研制和大规模生产奠定了基础。     

白血病融合基因EVI1的多态性与白血病发生风险的相关性

目的:探讨白血病融合基因亲嗜性病毒整合位点1(ecotropic viral integration site-1,EVI1)的多态性与白血病发生风险的相关性。方法:选取本院2017年2月～2019年2月收治的骨刺患儿90例作为研究组,同期选择健康人群83例作为对照组。清晨空腹抽取两组入选者的外周静脉血2 mL,采用PCR方法检测两组入选者EVI1的多态性情况,调查一般资料并进行相关性分析。结果:EVI1 rs17561基因共有CC、CA、AA三种基因型,两组入选者的EVI1 rs17561基因分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律,研究对象具有群体代表性。两组入选者EVI1 rs17561基因型分布差异具有统计学意义(P0.05),研究组的EVI1 rs17561基因CC基因型显著高于对照组(90.0%vs. 75.9%, P0.05),研究组的等位基因C频率(显著高于对照组(96.7%vs. 80.7%, P0.05)。在90例骨刺患儿中,6例患儿确诊为白血病,检出率为6.7%,均为CC基因型。研究组患儿EVI1 rs17561基因的CC基因型与血小板计数、危险度分层、诊断分型显著相关(P0.05)。多元Logistic回归分析显示血小板计数、危险度分层、诊断分型为影响EVI1rs17561CC基因型的主要因素(P0.05)。结论:白血病患儿融合基因EVI1多态性比较常见,多表现为rs17561CC等位基因,此等位基因可能与白血病患者的血小板计数、危险度分层、诊断分型显著相关,其中血小板计数、危险度分层、诊断分型为影响EVI1rs17561CC基因型的主要因素。     

军曹鱼催乳素受体PRLR1基因的克隆及其在不同盐度条件下mRNA表达差异

催乳素受体通过结合催乳素,能调节鱼体渗透压。为研究催乳素受体1(PRLR1)在高盐水体和低盐水体中对军曹鱼(Rachycentron canadum)的渗透调节作用,利用cDNA末端快速扩增(RACE-PCR)技术,获得了军曹鱼PRLR1全长cDNA序列。该基因全长为2629 bp,包含1953 bp的开放阅读框ORF,可编码650个氨基酸。氨基酸序列包含了2个纤维连接蛋白3型结构域(FN3)、保守的WS区和box1。采用qRT-PCR技术,检测不同盐度(10‰、30‰和35‰)条件下鳃、肠、体肾中PRLR1基因mRNA表达情况。结果显示,PRLR1基因在军曹鱼的各个组织中均有表达,其中鳃表达量最高,其次是肌肉、体肾和肠,而在胃、脾、脑和心脏中则微量表达。低盐组、正常组和高盐组中,PRLR1基因的表达量均为鳃最高;肠次之;体肾最低。随着盐度提高,PRLR1基因的鳃、肠和体肾组织表达量变化规律均呈逐步下降趋势。以上结果反映了军曹鱼PRLR1在渗透压器官中的功能差异性,说明PRLR1在军曹鱼渗透压调节上具有重要作用。     

小麦TaWRKYⅢ-A37和TaWRKYⅡc-D2基因的克隆与表达分析

为了探究小麦(Triticum aestivum L.)WRKY基因的功能,采用同源克隆的方法,从小麦品种‘科农199’中克隆得到2个WRKY基因,分别命名为TaWRKYⅢ-A37和TaWRKYⅡc-D2,并对其进行生物信息学分析和不同逆境胁迫下的表达分析。生物信息学分析显示,TaWRKYⅢ-A37和TaWRKYⅡc-D2基因都含有2个内含子和3个外显子,分别编码206和138个氨基酸,编码蛋白都属于亲水性不稳定非分泌型的核蛋白。系统进化分析表明,TaWRKYⅢ-A37蛋白与其两个同源拷贝的亲缘关系最近,而TaWRKYⅡc-D2蛋白与粗山羊草亲缘关系最近。qRT-PCR结果表明,TaWRKYⅢ-A37和TaWRKYⅡc-D2基因在小麦根、茎和叶中均有表达,前者在根中表达量最高,后者在叶中表达量最高,二者均在茎中低表达;在苗期TaWRKYⅢ-A37基因受到PEG、H_2O_2和ABA胁迫后表达上调,NaCl处理后4～8 h内表达下调且低于对照表达水平,而且在灌浆期受到PEG、NaCl、H_2O_2和ABA胁迫后表达均上调;苗期TaWRKYⅡc-D2基因在NaCl、H_2O_2和ABA胁迫后表达下调,PEG处理2 h时表达上调且高于对照表达水平,并且在灌浆期经PEG和NaCl胁迫后表达下调,受H_2O_2和ABA胁迫后表达上调。该研究结果为深入探究TaWRKYⅢ-A37和TaWRKYⅡc-D2基因的抗逆功能奠定了理论基础。     

地涌金莲MlCCD8b基因的克隆与表达分析

该研究以地涌金莲(黄色苞片型YN01和红色苞片型RD05)为材料,采用RACE技术克隆获得地涌金莲CCD8b基因的cDNA全长,进行氨基酸序列比对及系统进化树构建,并采用实时荧光定量PCR技术检测MlCCD8b基因在不同地涌金莲类型和不同组织中的表达模式。结果表明：(1)序列分析显示,MlCCD8b的ORF全长1 671 bp,编码556个氨基酸,存在1个类胡萝卜素加氧酶家族的典型保守结构域RPE65,推测其相对分子量为61 574.26 Da,等电点6.61,亚细胞定位于叶绿体基质中的类囊体上,所编码的MlCCD8b蛋白为亲水性蛋白。(2)同源对比分析及构建系统进化树发现,地涌金莲MlCCD8b蛋白与小果野蕉亚种、凤梨等单子叶植物的CCD8b蛋白遗传关系最近。(3)荧光定量PCR检测结果表明,MlCCD8b在吸芽数量多的黄色苞片型YN01的所有组织中均有表达,而在吸芽数量少的红色苞片型RD05中,其苞片内未能检测到MlCCD8b的表达,但其他组织中皆有表达;MlCCD8b在2种类型地涌金莲中呈现一致的组织表达特异性,即在花序轴中的表达量最高,其次是吸芽芽点、根尖和叶片,在苞片中的表达量最低或不表达。(4)2种类型地涌金莲同一组织部位比较结果显示,RD05的花序轴、吸芽芽点、根尖和叶片中的MlCCD8b相对表达量分别是YN01的4.47、4.67、2.09和1.10倍。(5)利用高效液相色谱 串联质谱法测得RD05根尖部位的5 脱氧独脚金醇含量是YN01的15.57倍,与MlCCD8b在根尖的表达趋势一致。研究认为,MlCCD8b基因可能通过调控独角金内酯的合成,促进或抑制地涌金莲吸芽的萌生。该研究结果可为MlCCD8b基因的生物学功能研究提供依据,并为今后通过分子辅助育种调控MlCCD8b的表达,从而控制地涌金莲吸芽数量提供理论支持。     

普通烟草NtODB基因的电子克隆、表达及生物信息学分析

ODB基因在植物同源重组依赖性的DNA双键断裂修复过程中起重要作用,对植物诱变育种具有潜在的应用价值。克隆烟草NtODB基因并分析其表达特征为丰富ODB基因在同源重组DNA修复过程中的作用提供证据。为得到烟草NtODB基因序列,采用电子克隆技术获得该基因cDNA序列并克隆验证。进一步使用生物信息学方法分析该基因表达特征,对预测蛋白的理化性质、信号肽、高级结构等进行预测。生物信息学分析结果表明,NtODB基因开放阅读框包含579个碱基,蛋白含192个氨基酸残基,NtODB蛋白具有碱性和亲水性,主要定位于细胞质内;实时荧光定量PCR检测结果显示NtODB基因在不同组织中呈现组成型表达特征;亚细胞定位检测提示NtODB主要表达于细胞膜和叶绿体。NtODB基因的克隆与表达分析及其蛋白高级结构和理化性质的预测,可为进一步丰富ODB基因在同源重组依赖的DNA修复系统中的作用机制提供证据。     

肥厚型心肌病患者在心肺运动中核心指标的特征性研究*

目的: 肥厚型心肌病（HCM）,以心肌肥厚为主要特征的心肌疾病,猝死率高。临床症状表现为呼吸困难、乏力、胸痛等。症状限制性极限运动心肺运动试验（CPET）在整体整合生理和医学（HIPM）理论指导下是唯一评估人体整体功能状态检查,肥厚型心肌病患者在心肺运动中核心数据变化值得进一步探讨。方法: 选择2017年4月至2020年1月在阜外医院就诊签署知情同意书后完成CPET受试者244例为研究对象,其中219例肥厚型心肌病（肥厚心组）和无诊断疾病健康人25例（正常组）,观察两组CPET核心指标的异同。结果: ①肥厚心组男163女56例,正常组11男14女;肥厚心组年龄（46.7±12.8,16.0~71.0）岁;正常组年龄（43.7±10.4,26.0~61.0）岁。②肥厚心组CPET核心指标的峰值摄氧量（Peak VO₂）为（65.2±13.8,22.8~103.4）%pred;无氧阈（AT）为（66.4±13.0,33.7~103.5）%pred;峰值氧脉搏（Peak O₂ pulse）为（84.3±19.0,90.9~126.0）%pred;摄氧效率平台（OUEP）为（99.2±13.4,69.1~155.5）%pred;分钟通气量和二氧化碳排出量比值最小值（Lowest VE/VCO₂）为（108.0±13.2,70.4~154.0）%pred;分钟通气量和二氧化碳排出量比值斜率（VE/VCO₂ Slope）为（108.5±17.9,66.9~164.9）%pred, 肥厚心组较正常组在峰值摄氧量,无氧阈,峰值氧脉搏,摄氧效率平台等百分预计值（%pred）等指标均显著降低（P<0.01或P<0.05）;而Lowest VE/VCO₂和VE/VCO₂ Slope（%pred）显著升高（P<0.05）,差异均有统计学意义。个体而言,部分患者就诊时整体功能状态尚在正常范围内。③CPET中Peak VO₂与其他核心指标AT、OUEP、Peak O₂ pulse、峰值收缩压呈正相关;与Lowest VE/VCO₂ 和VE/VCO₂ Slope呈负相关。结论: 肥厚型心肌病患者能安全完成CPET,CPET指标具有特异性,不仅可用于整体功能评测、疾病诊断与鉴别诊断、危险分层、疗效评估和精准预后预测,并可用于整体论指导下的个体化整体方案慢病有效管理,值得进一步深入研究和临床推广应用。