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131.
旨在克隆山羊Klf4基因,构建重组质粒pET30a-Klf4,通过原核表达技术获得纯化的His-Klf4融合蛋白。从山羊的生殖脊中提取总RNA,用RT-PCR的方法扩增Klf4基因编码区序列,通过TA克隆构建pMD18-T-Klf4重组质粒。酶切鉴定与测序分析后将Klf4的cDNA亚克隆至pET-30a载体,构建重组质粒pET30a-Klf4。酶切鉴定后将其导入大肠杆菌BL21中,用IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting检测确认,镍离子金属螯合亲和层析法纯化His-Klf4融合蛋白。结果表明:(1)从山羊生殖脊中克隆了Klf4基因,其开放阅读框由1 434个核苷酸组成,编码478个氨基酸,而且该序列与绵羊的同源性最高,达到98.5%;(2)经过SignalP 4.0在线分析,Klf4的编码蛋白不存在信号肽;(3)经SDS-PAGE和Western blotting分析表明,重组质粒pET30a-Klf4在大肠杆菌中得以表达;在变性条件下纯化,获得了His-Klf4融合蛋白。 相似文献
132.
小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草腥黑粉菌检测标准分子构建 总被引:1,自引:1,他引:0
以小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草腥黑粉菌为研究对象,采用分子克隆技术,分别构建了该两种真菌分子检测的标准分子。前者包括线粒体2297 bp的DNA序列以及rDNA710 bp的ITS序列,后者包括线粒体2.3kb的DNA序列以及rDNA710 bp的ITS序列。分别对该两个标准分子进行了性能评估试验,测试结果显示所构建的标准分子具有良好的特异性、均匀性和稳定性,能够满足小麦印度腥黑穗病菌和黑麦草腥黑粉菌分子检测需求。 相似文献
133.
为了从酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae中克隆出乙醇脱氢酶2(Alcoholdehy drogenase2,ADH2)基因并使之在大肠杆菌中高效表达。以酿酒酵母细胞中提取的总RNA为模板,通过反转录获得酿酒酵母乙醇脱氢酶2基因,连接到表达载体pTAT上,得到重组表达质粒pTAT-ADH2,将此重组质粒转化到大肠杆菌BL21中,重组工程菌株经IPTG诱导表达得到ADH2蛋白。将该蛋白纯化后,在体外进行活性检测和小鼠体内进行毒理试验,检测ADH2的酶活性。测序结果表明克隆的基因与GenBank中所报道的adh2基因序列有90%的同源性,经SDS-PAGE电泳分析,目的蛋白得到了有效表达,蛋白条带扫描分析表明,表达量占总蛋白的50%左右,纯化得到的蛋白在小鼠体内进行毒理试验,显示出一定的活性。酿酒酵母adh2基因的克隆正确,不仅在大肠杆菌中进行了高效表达而且表现出了较好的酶活性。 相似文献
134.
135.
人DFF45蛋白多克隆抗体制备及其初步应用 总被引:2,自引:1,他引:1
目的:表达、纯化带GST标签的DNA裂解因子45(DNA fragmentation factor 45 ,DFF45)融合蛋白并制备多克隆抗体。方法:构建pGEX-5X-1/DFF45原核表达质粒,转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导融合蛋白表达,经纯化后免疫日本大耳白兔得到多克隆抗体并用CNBr-activated Sepharose? 4B进行纯化。用间接ELISA法检测抗体效价,Western blot鉴定抗体特异性,同时用免疫荧光染色鉴定抗体特异性并观察DFF45的细胞定位。进一步检测DFF45在人类几种细胞系的表达差异情况。结果:成功构建原核表达质粒,表达、纯化DFF45蛋白并免疫动物后得到多克隆抗体。间接ELISA法显示抗体效价达1:20 000,Western blot确定抗体具有高度特异性。应用该抗体检测发现DFF45在人类几种细胞系中表达存在差异并观察到其细胞定位。结论:DFF45多克隆抗体的成功制备及其在人类细胞系的差异表达,为进一步研究DFF45基因与肿瘤及其相关疾病的关系奠定了基础。 相似文献
136.
克隆植物蛇莓基株的分子鉴定 总被引:1,自引:1,他引:0
采用随机扩增序列区间(ISSR)分子标记技术对蛇莓基株进行鉴定,结果表明6个ISSR引物在22个分株中共扩增出62个条带,每个引物扩增的条带数为4~16条,平均每个引物扩增的条带数为10.3条。采用6种引物对22个克隆分株的DNA扩增共产生28种带谱类型,其中有9种带谱为特异性带谱。综合分析这些带谱,确知这22个克隆分株分属16个基株。由带型可知,通过6个引物中的4种引物就可以把所有的基株鉴定出来,表明ISSR技术在分子水平上鉴定蛇莓的克隆基株是一种行之有效的方法。同时每个引物扩增出来的条带的多态性比例也比较高,平均达到90.3%。 相似文献
137.
马立克氏病病毒meq基因敲除株感染性克隆的免疫效果评价 总被引:1,自引:0,他引:1
【目的】比较和评价了敲除meq基因的MDV感染性克隆作为新型DNA疫苗的免疫保护效果。【方法】将1日龄SPF鸡饲养于正压过滤空气的SPF动物饲养隔离罩内。1日龄时,将SPF鸡以10μg/只的剂量通过大腿肌肉注射的方式接种溶解于PBS缓冲液中的敲除meq基因的MDV感染性克隆GX0101 Δmeq-BAC,分别在免疫后5天或12天以500PFU/只的剂量接种超强毒rMd5。饲养90天,观察死亡情况,对每一只鸡剖检并取心脏与肝脏做石蜡切片,进行病理观察。【结果】免疫5天后攻毒,CVI988/Rispens对超强毒rMd5的保护指数可达到87%,GX0101 Δmeq-BAC对rMd5的保护指数仅达33%;而免疫12天后对rMd5的保护指数为53%。【结论】相对于细胞结合疫苗CVI988/Rispens,DNA疫苗在机体内的病毒拯救是使其获得保护力的前提条件,因此有一定的免疫空当期。以GX0101 Δmeq-BAC作为疫苗免疫不仅能使雏鸡在受到超强毒感染时发病延迟,而且还能提供较好的免疫保护效果。 相似文献
138.
一类蛙源非典型结构抗菌肽cDNA的克隆以及成熟肽的预测 总被引:1,自引:0,他引:1
抗菌肽是两栖类非特异性免疫的重要组成部分,具有广谱的抗菌、抗病毒、抗肿瘤、抗寄生虫等活性,而且不易产生耐药性.抗菌肽的功能发挥与其特有的α螺旋结构密切相关,但是一些抗菌肽在水溶液中呈无规则卷曲,在类膜溶液中才转变成α螺旋,这类抗菌肽往往表现出极强的抗菌肽活性或细胞毒性,在药物开发中提供更多的利用潜能.本文从东北林蛙(Rana dybowskii)皮肤组织中,通过RT-PCR技术,克隆了一类无规则卷曲的抗菌肽,属于chensirin-2家族.19条不同的抗菌肽的cDNA序列共编码3种长度为14个氨基酸残基的成熟肽,分子量在1450.78-1460.82之间,理论等电点在9.53-9.70之间,3种抗菌肽都有两亲性和阳离子性,二级结构呈现无规卷曲.这些理化性质预示着这3种抗菌肽可能具有特殊的药用价值. 相似文献
139.
具选择性蛋白质降解功能的泛素在昆虫生长发育过程中起着重要的调控作用。本研究采用电子克隆的方法钓取家蚕基因组中多聚泛素基因序列,命名为Bm-polyUB(GenBank登录号:AADK01019318),并进行序列分析和电子表达谱预测。序列分析表明,该编码区长3426bp,编码1141个氨基酸残基的15聚体,预测分子量和等电点分别为127.97kD和7.33,二级结构中α-螺旋、延伸带、β-转角和无规则卷曲各占17.09%、32.78%、14.37%和35.76%,亚细胞定位于细胞质、细胞核和线粒体各占43.5%、34.8%和21.7%,无前导肽、信号肽和跨膜区;多重序列比对显示,15个泛素单体基因序列间同源性和遗传距离分别介于89.0%~100.0%和0.000~0.120,其中Bm-UB3与Bm-UB10、Bm-UB5与Bm-UB7及Bm-UB10与Bm-UB14的序列相同;遗传多样性分析可见,共检出33个多态性位点,共生成12个单倍型,单倍型多样性(Hd=0.962)、平均核苷酸差异数(K=7.495)、核苷酸多样性(Pi=0.03287)、密码子有效值(ENC=41.62361)、偏爱指标(CBI=0.4960)和χ2检验计算(χ2=0.713)显示泛素单体间遗传多样性较丰富且呈现较强的密码子偏爱性;电子表达谱预测结果表明Bm-polyUB基因在家蚕中高表达的组织和发育阶段所占比例显著高于低表达。本文的研究结果可为进一步开展该基因进化机制、表达特性和生理功能等方面的实验研究提供基础资料。 相似文献
140.