应用改良的mRNA差异展示法克隆人鼻咽上皮特异性表达的cDNA

本文对ｍＲＮＡ差异展示法进行了改良,利用一组随机引物与来源于ｍＲＮＡ翻译起始位点区域的引物组合进行ＲＴ－ＰＣＲ,使差异展示的片段来源于蛋白编码区,并对差异展示的条件进行了优化。应用此法对人鼻咽上皮与软腭口腔粘膜上皮扔基因表达进行了比较研究。得到了１０个在鼻咽上皮特异表达的ｃＤＮＡ片段,并对其中的５个片段进行了亚克隆和序列分析。通过与ＧｅｎｅＢａｎｋ数据库中的序列进行同源性比较,确定其中两个片段为未     

微波介导的载体快速转化及克隆筛选方法

应用微波辐射进行载体快速转化及重组体鉴定。经选择辐射转化条件,表明在低渗钙离子(0.05mol/L或0.1mol/L)条件下,150W、45s的辐射可得到理想的转化率。采用微波碎菌抽提质粒方法对重组体进行快速鉴定,不需特殊设备,省时、可靠。用该方法对肾综合征出血热病原汉坦病毒76-118株S片段基因进行克隆、转化和重组体鉴定试验,证实其具有简易、快速、高效等优点。     

小麦丛矮病毒NS蛋白基因的克隆及序列分析

利用与Ｎ蛋白ｍＲＮＡ３＇末端顺序相同的２０寡聚核苷酸引物,通过点杂交、限制性内切酶分析从小麦丛矮病毒（ＷＲＳＶ）ｃＤＮＡ文库中筛选到编码Ｎ蛋白基因下游顺序的ｃＤＮＡ克隆。序列分析表明,该ｃＤＮＡ片段含有一编码的４０ｋＤ蛋白的开放读框。将该读框的全长ｃＤＮＡ经ＰＣＲ扩增后,克隆到ｐＧＥＸ－３Ｘ上,在大肠杆菌ＤＥ３中用ＩＰＴＧ诱导表达,经蛋白质印迹鉴定,该基因为小麦丛矮病毒ＮＳ蛋白基因。     

鸡生长激素基因5′端部分调控区的克隆分析

利用PCR技术扩增、克隆、测序了7个跨越不同生长速度的鸡品种(系)的生长激素(GH)基因的5′端部分调控区。这7个品种(系)分别为:高生长速度的宝罗肉鸡父本;较高生长速度和一定的产蛋性能的宝罗肉鸡母本;肉蛋兼用型的芦花鸡;中等生长速度和中等体重的蛋鸡品种洛岛红和农大褐;生长速度较慢体重较轻的蛋鸡品种北京白鸡和生长速度很慢但又不是矮小型的地方品种丝毛乌骨鸡。所扩增的片段长度为760bp,包括了转录起始位点5′端侧翼区的473bp、两个可能的TATA框、组织特异性转录因子结合位点、第一个外显子和部分第一内含子。所有克隆的鸡GH基因5′端调控区与Tanaka发表的序列相比,均在-34碱基的位置上缺失一个胞嘧啶C,在 160与 161碱基之间多1个胸腺嘧啶丁,在 175碱基的位置上出现了以腺嘌呤A替换了鸟嘌呤G的情况。7个品种(系)之间的比较显示,鸡GH基因启动区具有极高的保守性,在具有不同生长速度的鸡品种间不存在任何差异。说明鸡的不同生长速度和成年体重,不是由于生长激素5′调控区变异造成的。鸡生长激素基因表达的差异可能受到内含子或3′端侧翼序列的影响。     

美洲商陆核基因组抗病毒蛋白基因的克隆及序列分析

通过ＰＣＲ扩增,从美洲商陆（Ｐｈｙｔｏｌａｃａａｍｅｒｉｃａｎａ）核基因组中克隆了商陆抗病毒蛋白基因,序列分析表明,该基因含８８５个核苷酸,与已报道的序列比较,核苷酸同源性为９９．３％。     

细胞色素P450 2D6缺陷型等位基因的家系分析

利用等位基因特民扩增法(ASA)为基础的基因分型法,对细胞色素P4502D6 (CYP2D6)缺陷型等位基因携带者的9个家庭共38个进行了基因分型,并与用右旋美沙芬为 探针的表型分型法进行对比,发现两种方法的结果是一致的,CYP2D6酶缺陷型等位基因呈常染色体隐性遗传。 Abstract:A genotyping method based on the principle of allele-specific amplification and a phenotyping procedure with dextromethorphan as a probe were employed in familial study of nine families with 38 members for the cytochrome P450 2D6(CYP2D6)deficient alleles——CYP2D6A,CYP2D6B,CYP2D6D and CYP2D6T.The results showed that the CYP2D6 deficient alleles were inherited as an autosomal recessive trait.     

油茶脂酰辅酶A脱氢酶基因的克隆与表达分析

以国审油茶(Camellia oleifera)良种‘华硕’种子为材料,在已构建的转录组和表达谱数据库基础之上,采用RACE技术,克隆获得油茶脂酰辅酶A脱氢酶基因的全长c DNA序列,命名为Co ACAD(基因登录号KJ910338)。该基因c DNA全长为2702 bp,含有2487 bp的开放读码框,编码828个氨基酸,分子量为92.4113 k D,理论等电点p I为8.47,具有2个比较明显的跨膜区和酪氨酸蛋白激酶活性位点LVHGDFRIDNLVF,存在5个亚结构域;在Co ACAD基因c DNA全长序列的基础上构建表达载体,其中原核表达载体在宿主细胞BL21(DE3)中成功诱导表达,获得表观分子量约为93 k D的目的蛋白;实时荧光定量PCR分析表明,Co ACAD基因在果实膨大期和成熟期上调表达,预示着Co ACAD基因可能在种子发育过程中参与能量供应过程的调控。     

甘蔗KNOX基因(Sckn1)的电子克隆及生物信息学分析

KNOX基因对植物顶端分生组织的形成和维持有至关重要的作用。本文选择功能已知的水稻KNOX基因(OSH1,Oskn1)为参考序列,采用电子克隆技术克隆到甘蔗中与OSH1同源的一个KNOX基因Sckn1,并通过生物信息学分析预测该基因的结构、功能。结果表明:该基因包含一个1 071 bp的开放阅读框,编码356个氨基酸,分子量为39.36 kD,理论等电点为6.47。该基因很可能定位于细胞核,起转录调控作用,序列比对发现该基因编码蛋白与高粱、玉米、小米草等KN1蛋白高度相似。以上分析结果为进一步研究Sckn1基因的功能奠定了坚实的基础。     

棉铃虫β-catenin的多克隆抗体制备及在蛹脑中的表达研究

β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路的重要成员。本研究构建β-catenin的原核表达载体,成功地在大肠杆菌Escherichia coli中进行表达。镍柱纯化重组蛋白后免疫兔子,制备了抗棉铃虫β-catenin的多克隆抗体。ELISA和Western blot的方法检测抗体效价和抗体特异性,结果表明抗体的效价较高,特异性较好。最后应用该抗体调查了滞育和发育蛹脑中β-catenin的表达情况,从蛋白水平证实了发育蛹脑中β-catenin高于滞育蛹脑。本研究为后续研究棉铃虫β-catenin的功能以及Wnt/β-catenin信号通路在棉铃虫发育中的作用奠定了基础。     

苜蓿夜蛾保幼激素酯酶cDNA的克隆、序列分析及表达研究

【目的】研究苜蓿夜蛾Heliothis viriplaca保幼激素酯酶(Juvenile hormone esterase,JHE)的功能和作用机理。【方法】本试验提取苜蓿夜蛾的总RNA,并利用RT-PCR和RACE技术,扩增得到苜蓿夜蛾保幼激素酯酶基因的全长c DNA序列,命名为Hvjhe(Gen Bank登录号:JQ901384)。【结果】该基因含有3 106 bp,包括一个1 746 bp的开放阅读框,编码一个含581个氨基酸的多肽,分子量约为63.9 ku,多肽的等电点为5.11,且氨基酸序列具含有5个保幼激素酯酶特有的氨基酸保守模块。推导的氨基酸序列与烟芽夜蛾Heliothis virescens和棉铃虫Helicoverpa armigera中获得的保幼激素酯酶相似性较高,分别达到83%和82%。荧光定量PCR结果表明,该基因在苜蓿夜蛾不同发育时期和不同组织中都有m RNA水平的特异性表达,且在预蛹期表达量相对较高,取食期、蛹期期和成虫期表达量相对较低;在中肠和脂肪体内的表达量相对于其它组织较高。该基因在大肠杆菌Escherich coli表达系统中进行了诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,表达出与预测的蛋白分子量相符的融合蛋白。【结论】研究结果表明本试验获得了苜蓿夜蛾中一个新的保幼激素酯酶基因的c DNA序列。