单纯疱疹病毒II型糖蛋白G主要抗原表位的表达和抗原性检测*

利用PCR拼接技术,合成含单纯疱疹病毒II型糖蛋白G(gG2)抗原表位（氨基酸序列第561～578位）的片段,并进一步利用基因工程技术获得该表位的双拷贝片段,克隆入pET-KDO表达载体进行原核表达。经IPTG诱导后,高效表达出分子量大小约为39,000D的融合蛋白,经Western-blot检测具有良好的抗原性。表达的融合蛋白经凝血酶切割和亲和层析纯化,得到双拷贝gG2（561～578aa）目的蛋白,经ELISA检测具有良好的灵敏度和特异性。该重组抗原的构建和表达可用于HSV-2特异性血清学诊断的研究。     

人乳头瘤病毒(HPV)基因芯片的研究

探讨将基因芯片与限制性显示技术相结合对HPV进行基因检测和分型的方法。分离HPV6,11,16和18型的基因片段作为探针,纯化后应用PixSys 5500点样仪将其打印在氨基包被的玻片上制作HPV基因芯片,对HPV样品进行荧光标记后与芯片杂交,经清洗和干燥后对芯片进行扫描和结果分析。对HPV基因检测芯片的制作与检测的实验条件进行了初步研究,并对应用HPV基因芯片进行分型做了初步探讨。建立的检测芯片实验方法可行,并且显示了在HPV分型中的应用前景。     

中国假鹰爪属和皂帽花属植物叶的形态结构及其分类学意义

利用扫描电镜技术、叶片离析法和石蜡切片法研究了假鹰爪属Desmos 4种植物和皂帽花属Dasy-maschalon 3种植物叶片的形态结构。结果表明：假鹰爪属植物叶片近轴面表皮具大型球状含晶簇细胞和不含晶簇的表皮细胞两种类型,远轴面表皮细胞均具一较小的晶簇;叶肉组织明显分化为栅栏组织细胞和海绵组织细胞,油细胞分布于第2层的栅栏组织和海绵组织内,单位毫米叶宽油细胞数为4～6个;主脉维管组织被薄壁细胞分隔成束状。皂帽花属植物叶片近轴面表皮细胞形状相同,均具一晶簇,远轴面表皮细胞的晶簇和近轴面表皮细胞的晶簇相似;靠近上、下表皮的叶肉组织均分化为栅栏组织细胞,在两层栅栏组织细胞之间分化为一至几层海绵组织细胞,油细胞分布于海绵组织内,单位毫米叶宽油细胞数为2～3个;主脉维管组织形成连续的环状。由此可见两属叶的结构具有明显的差异,因而支持假鹰爪属和皂帽花属为两个独立属的观点。     

重组人干细胞因子在昆虫细胞中的高效表达

含信号肽的可溶性人干细胞因子（ｈＳＣＦ）ｃＤＮＡ 基因重组于杆状病毒转移载体ｐＶＬ９４１ 中,重组转移载体ｐＶＬ９４１ＳＣＦ与野生型苜蓿夜蛾核型多角体病毒（ＡｃＮＰＶ）ＤＮＡ 共转染草地夜蛾细胞Ｓｆ９ 后,通过体内同源重组构建了重组病毒ＡｃＮＰＶＳＣＦ。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ 杂交表明重组病毒基因组中含有ｈＳＣＦ基因片段。重组病毒感染单层Ｓｆ９ 细胞后,表达产物分泌到胞外培养液中。用ＭＴＴ 比色法和ＴＦ１ 细胞株测定表达产物与ＩＬ３ 的协同效应,测得感染重组病毒的培养细胞第三天表达量为１９７０ ｕｎｉｔｓ／ｍ Ｌ培养液。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ 分析可见分子量为１８ ×１０３ 、２０ ×１０３ 和２２ ×１０３ 三条带。     

芒果畸形病病原菌Fusarium mangiferae的快速分子检测

芒果畸形病是芒果上的重要病害之一,由镰孢菌侵染引起,其中以Fusarium mangiferae为主要致病菌.该病害诊断困难,且难于有效控制,因此,一旦发生则对芒果生产造成严重威胁.研究基于ISSR分子标记技术,从50条已知引物中筛选得到一条目的引物UBC 888,该引物可稳定扩增出大小为479bp的F. mangiferae特异性条带(GenBank Accession No. KJ526382).根据获得的特异性片段序列设计引物,成功地将ISSR标记转化为SCAR标记,并获得一对SCAR特异性引物(W342,W1772)和一段大小为1 376bp的特异性扩增片段(GenBank Accession No. KJ526383).通过优化特异性引物扩增条件,获得最适退火温度,构建芒果畸形病病原菌F. mangiferae的快速分子检测技术.此技术操作简单,特异性强,可检测真菌DNA的含量最低为10pg,适用于F. mangiferae和田间带菌芒果组织高灵敏度快速检测,为芒果畸形病的早期诊断和及时预防提供可靠理论依据和技术方法.     

通过形成类胚体诱导人羊水多能干细胞向心肌细胞分化

由人羊水中分离羊水多能性干细胞,通过形成类胚体诱导其向心肌细胞分化.取人羊水标本进行体外培养,分离得到人羊水干细胞,已连续传代培养至42代,采用免疫细胞化学、RT-PCR和流式细胞仪技术对羊水干细胞的生物学特性进行检测.取10～15代羊水干细胞,悬浮培养使其形成类胚体,进而向心肌细胞诱导分化.培养的羊水干细胞呈成纤维样,表达部分胚胎干细胞特异标志基因,悬浮培养可形成类胚体.类胚体碱性磷酸酶(AP)检测呈阳性,表达三胚层特异标志基因fgf5、ζ-globin和α-fetoprotein.羊水干细胞形成类胚体后进行诱导,得到α-actin阳性细胞,表达心肌细胞特异标志基因Tbx5、Nkx2.5、GATA4和α-MHC.试验结果表明,从人羊水标本中可分离得到具有胚胎干细胞特性的细胞,经初步检测确定为羊水干细胞,并能通过形成类胚体诱导其向心肌细胞分化.     

酵母双杂交技术研究与人孕酮受体B相互作用的蛋白质

应用酵母双杂交技术研究与人孕酮受体B（hPRB）发生相互作用的蛋白质,有助于进一步阐明其在乳腺癌的发生发展中发挥重要作用的调控机制。应用酵母双杂交系统3,以hPRB不同结构域为诱饵,筛选人乳腺cDNA文库,寻找能与之相互作用的蛋白质,并运用X—α—Gal等实验提供的信息,筛除假阳性克隆。最终以AF1-DBD结构域作为诱饵最终筛出了1个阳性克隆,经测序及生物信息学分析,这个克隆所编码的蛋白为PIAS3（活化的STAT3的蛋白抑制剂）。结果表明,孕激素受体可以和PIAS3发生相互作用,它们的相互作用有可能参与乳腺癌的生长调控。     

人肺鳞癌组织的血清蛋白质组学的比较分析

采用以肿瘤免疫学与蛋白质组学(proteomics)研究技术有机地结合为基础的血清蛋白质组学研究体系(serologicproteomeanalysis ,SERPA)筛选肺癌分子标志物.对10例人肺鳞癌组织,应用双向凝胶电泳(two dimensionalelectrophoresis ,2 DE)技术对同一肺鳞癌组织的细胞总蛋白同时进行电泳后获得3张相同的凝胶,其中一块2 DE凝胶经银染显色作为平行胶,其余两块2 DE凝胶经电转膜将凝胶中的蛋白质转至硝酸纤维素(NC)膜上,然后分别与肺癌患者的自身血清以及正常对照血清进行Western印迹分析,获取Western印迹反应图谱.经计算机图像分析识别差异反应的蛋白质,然后与平行胶比较找出相应的差异反应蛋白质点.获得了分辨率较高的人肺鳞癌组织与患者的自身血清以及正常对照血清的Western印迹反应图谱;图像分析共识别36±8个差异反应的蛋白质;在平行胶上找到了匹配的差异反应蛋白质点.对2 0个差异蛋白质点进行了肽质指纹图分析,鉴定出14个与细胞生长增殖、细胞代谢、细胞周期调控、信号转导等有关的肺鳞癌相关抗原.通过血清蛋白质组技术对肺鳞癌组织进行的研究,建立了分辨率较高的人肺鳞癌组织与患者的自身血清以及正常血清的Western印迹反应图谱,成功鉴定14个肺鳞癌相关抗原,为进一步筛选用于肺鳞癌诊断、治疗和预后评估     

菜蛾盘绒茧蜂主要寄生因子导致的寄主小菜蛾幼虫脂肪体结构的变化

在不同的寄生状态下,菜蛾盘绒茧蜂Cotesia plutellae不同的寄生因子可引起寄主小菜蛾Plutella xylostella幼虫脂肪体结构发生相应的改变。显微和亚显微形态结构显示： 假寄生后多分DNA病毒和毒液对脂肪体结构的完整性没有显著影响,但细胞内脂质体变得小而密集,线粒体和内质网丰富,并有糖原积累; 正常寄生后,脂肪体结构被破坏,多数线粒体内嵴紊乱,脂质体也变得不规则,特别是当幼蜂完成在寄主体内发育时,寄主体内几乎无完整脂肪体存在。与此同时,同批未被寄生的小菜蛾幼虫发育到4龄末期时,体内脂肪体细胞发育正常,已开始向蛹期细胞形态转化,细胞内脂质体很大,细胞器数量较多、糖原积累丰富, 而且部分细胞已成为游离态细胞。由此证明,寄生蜂携带的寄生因子,如多分DNA病毒、毒液、畸形细胞和幼蜂等,均对寄主脂肪体结构的改变产生影响,但程度明显不同。     

人小肠三叶因子在糙皮侧耳中的整合、表达及检测

用原生质体法将含双 35S_AMV启动子及人小肠三叶因子 (hITF)cDNA的表达载体导入糙皮侧耳 (Pleurotusostreatus)中 ,原生质体转化子在含有除草剂的培养基上初步筛选 ,获得抗性菌株。通过PCR分析证明hITFcDNA已整合到侧耳基因组中。以hITF为抗原免疫家兔制备了抗血清 ,纯化后的IgG以直接型酶联免疫吸附检测 (ELISA)方法测定效价 ,并建立起hITF的竞争型酶联免疫吸附检测 (ELISA)方法 ,给出了标准工作曲线 ,以应用于大规模表达菌株的筛选确立。检测表明 ,hITF在侧耳新鲜菌丝体中分 3个表达量段 :10 0 0～ 12 5 0ng g、14 80～ 170 0ng g、最高达2 0 0 0～ 2 2 5 0ng g ,约占总可溶性蛋白的 0 7%～ 1 5 %。Western印迹进一步分析证明hITF在侧耳中的表达。