一种新的抗菌药物靶标蛋白质(3，4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸合成酶)的克隆、表达、纯化及酶活性鉴定

[目的]核黄素( vitamin B12,riboflavin)是辅因子黄素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide,FAD)和黄素单核苷酸(flavin mononucleotide,FMN)的前体物,对生物体的生物合成至关重要.如果细菌不能够从外界摄取足够的黄素( flavin)就需要自身合成核黄素以维持菌体的生存与增殖.3,4-二羟基-2-丁酮-4-磷酸合成酶(3,4-Dihydroxy-2-butanone-4-phosphate synthase,DHBPs)为核黄素生物合成途径中关键酶之一.在镁离子存在的情况下,DHBPs将5-磷酸核酮糖(ribulose-5 -phosphate,Ru5P)转换成3,4-二羟基-2-丁酮4-磷酸(3,4-dihydroxy-2-Bu-tanone-4-Pho-sphate,DHBP)和甲酸盐(formate),生成的DHBP为核黄素合成的必需原料之一.人类没有合成核黄素的相关途径,因此细菌参与合成核黄素的DHBPs等相关酶就有望成为抗菌药物作用的靶位点.本课题通过对肺炎链球菌的DHBPs进行克隆表达纯化与酶学性质鉴定,为开展其三维结构的解析和抗菌药物设计提供重要的工作基础.[方法]利用PCR技术扩增DHBPs基因,构建重组表达载体pW28-DHBPs.将其转入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21( DE3)中表达,用Ni离子亲和层析及离子交换(DEAE)纯化获得有活性的DHBPs后,进行酶学性质鉴定.[结果]酶切和测序证实成功构建了质粒pW28-DHBPs,在E.coli BL21中表达了可溶性DHBPs,纯化后获得了纯度为95％的靶蛋白质,经分子筛分析DHBPs在溶液中以二聚体形式存在.对DHBPs进行酶学性质分析表明,在25℃、pH为7.5和Mg2+存在的情况下,DHBPs具有将5-磷酸核酮糖转换成DHBP和甲酸盐的活性.[结论]第一次成功克隆并在E.coli BL21中表达了一种肺炎链球菌合成核黄素的相关酶—DHBPs,纯化后的重组DHBPs具有较好的5-磷酸核酮糖分解活性,这为解析其三维结构和基于结构进行的新一代抗菌药物设计提供重要的工作基础.     

酸性土壤中高效半纤维素降解菌的筛选与鉴定

【目的】筛选能够适应南方酸性土壤的高效半纤维素降解菌株,并进行鉴定,确定菌株的安全性。【方法】采用半纤维素平板水解圈法和胞外酶测定法进行菌株筛选,通过拮抗实验构建复合微生物菌系。利用培养特征、形态学、生理生化特征和分子生物学方法进行菌株鉴定。【结果】筛选出效果稳定,互不拮抗的高效半纤维素降解放线菌4株(NA9、NA10、NA12和NA13),半纤维素酶活分别为:217.6、229.8、221.1和211.8 U/mL。真菌2株NF1和NF7,半纤维素酶活为217.7和244.2 U/mL。复合微生物菌系半纤维素酶活可达299.0 U/mL。经鉴定菌株NA9、NA10、NA12和NA13为链霉菌中的哥斯达黎加链霉菌(Streptomyces costaricanus)。菌株NF1为亮白曲霉(Aspergillus candidus),菌株NF7为黄蓝状菌(Tarlaromyces flavus)。     

三种创伤弧菌免疫原的制备及其对黄姑鱼的免疫保护效果

从创伤弧菌(Vibrio vulnificus)中提取菌体脂多糖(lipopolysaccaride,LPS)和外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)并制备福尔马林灭活全菌苗(FKC),腹腔注射接种黄姑鱼。分别在注射第0、7、14、21和28天后测定了受免鱼血清中凝集抗体效价、血清溶菌酶活性和血液白细胞吞噬活性,以及免疫28d后的相对免疫保护率。结果表明,3种抗原对黄姑鱼均有较强的免疫原性。免疫后,免疫组血清凝集抗体效价逐渐增高,第28天时最高;溶菌酶活性(LMZ)、白细胞吞噬活性(PP)和吞噬指数(PI)显著升高(P<0.01),第21天达到峰值,随后逐渐下降。各组之间比较表明,受免后7、14、21和28d,免疫组黄姑鱼凝集抗体效价、PP、PI和LMZ显著高于对照组(P<0.05),LPS和OMP组凝集抗体效价低于FKC组,LPS和OMP组的相对免疫保护率高于FKC组,各组间免疫保护率大小顺序为LPS组>OMP组>FKC组>对照组。     

短期放牧对草甸草原土壤微生物与土壤酶活性的影响

【目的】为呼伦贝尔草甸草原生态系统的保护、恢复及重建提供微生物学基础数据。了解草原土壤微生物和酶活性对放牧强度的响应。【方法】分别采集六个不同放牧强度的土壤样品,测定土壤微生物数量、土壤微生物量和土壤酶活性,分析短时期不同放牧强度土壤微生物数量、土壤微生物量和土壤酶活性的变化特征及其相互关系。【结果】不同放牧强度下,菌群数量分布为细菌>放线菌>真菌;土壤微生物数量、微生物量均表现为放牧区高于对照区;在土壤表层(0 10 cm),土壤过氧化氢酶、转化酶和蛋白酶活性表现出随放牧强度的增加先上升后略降的趋势,且放牧区均高于对照区,与土壤表层比较,在较深层(10 cm 20 cm),土壤细菌、真菌的数量和微生物量碳、氮下降幅度随放牧强度的增大而增大。土壤微生物数量、微生物量及土壤酶活性的垂直分布为0 10 cm>10 cm 20 cm。相关分析结果表明:放牧干扰条件下,土壤微生物数量与微生物量之间均存在显著或极显著的相关性。土壤酶活性与微生物数量、微生物量密切相关,过氧化氢酶、转化酶与细菌、放线菌极显著相关(P<0.01)、与微生物量碳显著相关(P<0.05);蛋白酶与真菌及微生物量碳、氮极显著相关(P<0.01),与细菌显著相关(P<0.05)。【结论】适度放牧可使土壤微生物数量、微生物量和土壤酶活性增加。土壤微生物数量、微生物量与土壤酶活性之间具有密切关系。     

河西走廊春季不同盐碱土壤中微生物数量、酶活性与理化因子的关系

【目的】揭示盐碱土壤微生物量与土壤因子间的关系。【方法】选择河西走廊不同盐碱程度的11个样点在春季进行采样,研究了土壤的微生物数量、酶活和理化性质,并对其进行方差分析、简单相关分析、逐步回归分析和主成分分析。【结果】河西地区原生盐碱地、次生盐碱地与农田土在土壤理化性质和土壤微生物数量等方面均有差异;河西地区土壤较贫瘠,土壤微生物数量较低,且分布有规律性,即原生盐碱土<次生盐碱土<农田土;放线菌、真菌、碱性磷酸酶、脲酶和有效磷5个因子是引起土壤微生物数量、酶活性与理化因子之间相关性的主要因素。【结论】结果证实河西地区盐碱土壤中磷的循环很大程度上影响着土壤微生物数量。     

日本三宅岛火山土壤中硫代硫酸盐氧化菌的分离、生物学特性及鉴定

【目的】利用培养法从日本三宅岛火山土壤(堆积年限131年)中分离到一株能氧化分解硫代硫酸盐的细菌MU2A-22T。【方法】用培养法对该菌株MU2A-22T进行了生理生化性质以及分类学位置上的确定。【结果】菌株MU2A-22T为革兰氏阴性,短杆状或球状。理化性质表明该菌株能利用葡萄糖、L-阿拉伯糖、葡萄糖酸盐、己二酸酯、dL-苹果酸钠、硫代硫酸钠(最适浓度为2.5 mmol/L)为唯一碳源进行自养生长。最适生长温度为25°C 30°C,最适pH为6.0 8.0。菌株MU2A-22T的16S rRNA序列与菌株Paracoccus solventivorans 6637T亲缘关系最近,序列相似性为97%,编码核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶(Rubisco)的基因也被确定。对Paracoccus属内几种近缘菌的脂肪酸分析,证明菌株MU2A-22T中含有Paracoccus属的特征氨基酸,其中含量大于10%的分别为C18:1(74.7%)和C18:0(12.1%)。DNA-DNA杂交实验表明,菌株MU2A-22T与Paracoccus solventivorans 6637TDNA的相似度为49.3%。MU2A-22T菌株G+C含量为66.5%66.7%。【结论】菌株MU2A-22T为Paracoccus属内的一新种菌(登录号GQ452286),命名为Paracoccus scorialis sp.nov.。     

热量限制通过HNF3γ下调NOX4表达来抑制内皮细胞的衰老

为了观察热量限制对主动脉内皮细胞中HNF3γ及NOX4基因表达的影响, 揭示HNF3γ-NOX4-活性氧通路介导热量限制抗内皮细胞衰老的分子机制, 文章将主动脉内皮细胞分为5组：对照组、高热量组、低热量组、siRNA+低热量组、siRNA+高热量组。应用逆转录实时定量PCR(Real-time quantitative PCR, RT-qPCR)、Western blotting分析各组HNF3γ、NOX4 mRNA及蛋白水平变化, 并检测各组细胞内活性氧产量及细胞衰老程度变化。采用染色质免疫共沉淀分析HNF3γ蛋白与NOX4基因启动子区域结合情况, 萤光素酶报告基因检测HNF3γ蛋白结合后对NOX4基因启动子活性的影响。结果显示：与对照组比较, 低热量组HNF3γ mRNA和总HNF3γ蛋白表达水平、磷酸化/总HNF3γ比值显著升高(P<0.05), NOX4 mRNA和蛋白表达水平、细胞内活性氧产量及细胞衰老程度显著降低(P<0.05); 高热量组HNF3γ mRNA和总HNF3γ蛋白表达水平、磷酸化/总HNF3γ比值显著降低(P<0.05), NOX4 mRNA和蛋白表达水平、细胞内活性氧产量及细胞衰老程度显著升高(P<0.05); siRNA+低热量组及siRNA+高热量组中NOX4 mRNA和蛋白表达水平、细胞内活性氧水平及细胞衰老程度显著升高(P< 0.05)。染色质免疫共沉淀证实HNF3γ蛋白可与NOX4基因启动区域4个结合位点(-6 bp、-76 bp、-249 bp、-954 bp)结合。萤光素酶报告基因检测显示HNF3γ蛋白与NOX4启动子区域1个位点(-6 bp)、2个位点(-6、-76 bp)、3个位点(-6、-76、-249 bp)、4个位点(-6、-76、-249、-954 bp)结合, 可使NOX4启动子活性分别降低至对照组的80.15±4.64%、40.02.±2.15%、16.46±2.24%、12.13±1.46%, P<0.05。上述结果提示热量限制可上调HNF3γ基因表达, 增强HNF3γ蛋白活性, 促进HNF3γ蛋白同NOX4基因启动子区域结合, 抑制NOX4基因表达, 进而减少细胞内活性氧产生而延缓动脉内皮细胞衰老。     

采伐干扰对林下草本根系生物量与土壤环境异质性关系的影响

结合统计学和地统计学的理论,探讨了采伐干扰对华北落叶松林下草本根系生物量空间异质性及与林下土壤含水量、全氮、硝态氮、铵态氮、pH及华北落叶松细根生物量空间异质性的关联性。结果表明,采伐干扰样地草本根系生物量为 31.17 g/m²,明显小于未干扰样地(72.01 g/m²);采伐干扰导致草本根系生物量更多地向表层积聚。0~10 cm土层,采伐干扰样地草本根系生物量的空间异质性(C₀+C=31330.0)和空间自相关性(C/C₀+C=92.5%)明显增强,表现出较强的空间依赖性。采伐干扰后,土壤水分、全氮、硝态氮和铵态氮对草本根系生物量的相关性增强;未采伐干扰样地华北落叶松细根生物量与草本根系生物量的相关性较强。     

节节麦-黑麦双二倍体α醇溶蛋白基因的克隆与序列分析

以人工合成节节麦-黑麦双二倍体基因组DNA为模板,用小麦种子醇溶蛋白保守引物进行PCR扩增,经克隆测序获得了843~897 bp共15个新的DNA序列(GenBank登录号为: JQ029719,JQ046392~JQ046405),分别编码280~298个氨基酸。序列比对结果表明,它们具有α-醇溶蛋白基因的典型结构特点,是α-醇溶蛋白基因家系成员,其中有两个序列为同义突变。利用14个新氨基酸序列与乳糜泻(celiac disease)病人毒性抗原相关序列的比对,发现有8个序列的Glia-α-2和Glia-α-9型抗原序列产生缺失和替换。与来自粗山羊草属和黑麦属的α-醇溶蛋白基因的编码氨基酸建立系统树,结果表明,14个DNA序列编码的氨基酸序列与粗山羊草属的相关序列聚在一起。     

西秦岭地区志留/泥盆系过渡带中的鱼类微体化石及其组合序列

西秦岭是开展华南板块志留/泥盆系界线层序研究的一个重要地区.该区普通沟剖面中的志留/泥盆系过渡带包括羊路沟组上部和下普通沟组下部,产丰富的鱼类微体化石,包括花鳞鱼类、棘鱼类、软骨鱼类及盾皮鱼类.这些化石构成两个完全不同的鱼类微体化石组合:羊路沟组合和下普通沟组合.通过与波罗的海等地区鱼类微体化石带的对比,羊路沟和下普通沟组合的地质时代分别为志留纪普里道利世晚期和早泥盆世洛霍考夫期早期.西秦岭地区志留/泥盆系过渡带中的鱼类微体化石及其组合序列的研究,为该区志留/泥盆系界线的精确确定提供了重要的古鱼类学证据.