新疆大麦条纹花叶病毒的研究——Ⅰ.病毒株系类型的鉴定及核酸的体外翻译

我国大麦条纹花叶病毒(BSMV)新疆分离物的RNA,在50％甲酰胺6％甲醛中,50℃处理15分钟,使RNA分子链呈真正的均一状态后,在含甲醛的琼脂糖凝胶上电泳,核酸变性电泳结果显示该病毒为三组分RNA株系,编号为RNA_1,RNA_2,RNA_3,分子量分别为1.40—1.44×10~(?),1.20—1.28×10~0,1.06—1.09×10~6。经制备凝胶电泳分离出的各RNA组分在兔网织红细胞溶胞液的无细胞体系中,RNA_1的翻译产物为120K的蛋白,RNA_2翻译产物主要为25K和一个85K蛋白,其中25K蛋白由于与天然BSMV外壳蛋白共电泳,该蛋白中没有甲硫氨酸,以及能被BSMV抗血清沉淀,而被确定为BSMV外壳蛋白。RNA_3的翻译产物为75K蛋白。     

营养因素对日本血吸虫毛蚴人工转变母胞蚴及体外培养的影响

本文报道了4种培养基,4种血清,不同浓度的半乳糖,二巯基苏糖醇及部分三羧酸循环中间产物对日本血吸虫毛蚴体外转变为母胞蚴及其存活的影响,发现稀释一倍的RPM1 1640加10％兔血清为较适宜的培养基,上述添加剂对毛蚴转变和母胞蚴存活均无有益作用,其中柠檬酸可显著抑制毛蚴的转变,文中描述了毛蚴的体外转变成母胞蚴的过程,对血吸虫的糖代谢途径进行了讨论。     

与TMV-RNA装配起始位点互补的cDNA片段对TMV体外装配的抑制

合成了与TMV-RNA病毒装配起始位点互补的、长度为二十个核苷酸的DNA片段。该片段用~(32)P标记后,代替反义RNA(antisense RNA)与TMV-RNA进行硝基纤维素膜点杂交和溶液杂交。结果表明,该cDNA片段在两种条件下均能与TMV-RNA进行杂交。将溶液杂交的RNA-cDNA复合体经酒精沉淀,再与TMV衣壳蛋白的20S聚合体制剂进行体外装配,用测定310nm吸收光谱变化和电子显微镜观察的方法鉴定装配结果。实验证明,该cDNA片段与TMV-RNA杂交后抑制了装配起始位点的活力,从而使TMV病毒颗粒的装配不能完成。这一结果提示,TMV基因装配起始位点顺宁的cDNA和反义RNA能够在体外抑制TMV病毒颗粒的装配。     

周期型马来丝虫感染期幼虫在人卵巢癌细胞系中的体外培养

周期型马来丝虫感染期幼虫(L_3)在三种含人卵巢粘液性囊腺癌细胞系(OMC_(685))的RPMI1640培养系统中均能蜕皮发育为L_4,幼虫最长存活66天,蜕皮率和完成蜕皮率可分别达57.1％和89.3％。在不含细胞系的培养液中,幼虫最长存活14天,基本上不蜕皮。本实验结果提示OMC_(685)细胞系可能产生某些有利于周期型马来丝虫L_3体外生存和发育的物质。     

鼠疟原虫动合子体外培养及其生物学活性的研究

体外形成的动合子能否感染蚊媒并继续在蚊体内发育是评价体外形成动合子发育成熟的重要指标。它关系到动合子-卵囊阶段的体外培养和整个蚊期疟原虫的培养。由于体外形成动合子的培养物中含有大量各阶段的疟原虫,对检验体外形成动合子的生物活性造成一定的困难。为此我们对约氏疟原虫动合子进行培养和分离,并检测了体外形成动合子的生物活性。     

吡喹酮在体外培养中对日本血吸虫童虫超微结构影响的电镜观察

吡喹酮(Praziquantel,PZ)是目前最优良的非锑类抗血吸虫药,实验证明,PZ对埃及、曼氏及日本血吸虫病疗效均佳,对体外培养的日本血吸虫成虫、曼氏血吸虫成虫及自由生活期幼虫均有很强的杀灭作用。有关PZ对血吸虫作用的文献很多,但迄今尚未见有关PZ在体外培养中对日本血吸虫童虫超微结构影响的文献报道。本文报道利用血吸虫童虫体外培养技术,在超微结构水平观察PZ对日本血吸虫肝门型童虫形态学影响。     

中华蜜蜂细胞色素P450基因及其全长转录本的鉴定及分析

【目的】利用纳米孔(nanopore)测序技术鉴定中华蜜蜂Apis cerana cerana工蜂幼虫肠道中细胞色素P450(cytochrome P450, CYP450)基因及其全长转录本,为后续功能研究提供参考信息和基础。【方法】通过Nanopore PromethION平台对中华蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道进行转录组测序。利用Guppy软件对原始读段(raw reads)进行质控以得到有效读段(clean reads)。通过识别两端引物鉴定全长转录本序列。使用BLAST工具将上述全长转录本的序列比对到Nr和GO数据库以鉴定CYP450基因及其全长转录本。采用Astalavista软件鉴定基因的可变剪接(alternative splicing, AS)事件。通过RT PCR验证不同类型AS事件的可靠性。【结果】在中华蜜蜂工蜂4-6日龄幼虫肠道中分别测得7 338 627, 7 003 419和7 434 233条原始读段,经质控得到的有效读段数分别为7 289 494, 6 959 880和7 387 756条。鉴定到的非冗余全长转录本总数为48 200条。共鉴定到47个CYP450基因和265条CYP450基因全长转录本。共鉴定到CYP450基因的90次AS事件,包括36次外显子跳跃事件、20次可变5′端剪接位点事件、17次内含子保留事件、9次可变3′端剪接位点事件及8次外显子互斥事件。RT PCR结果证实随机选取的3种AS事件类型真实可靠。【结论】鉴定了中华蜜蜂的CYP450基因及其全长转录本,补充了东方蜜蜂参考基因组的相关注释,并揭示中华蜜蜂CYP450基因可通过多种AS类型产生丰富的剪接体。     

EB病毒衣壳抗原IgM抗体检测试剂参考品的建立

目的 建立EB病毒衣壳抗原IgM抗体检测试剂国家参考品并制定质量标准。方法 收集并筛选EB病毒衣壳抗原IgM抗体阳性和阴性血浆样本,建立EB病毒衣壳抗原IgM抗体检测试剂国家参考品并进行均匀性和稳定性研究,经10个实验室的协助标定,确定参考品的质量标准。结果 建立的EB病毒衣壳抗原IgM抗体检测试剂国家参考品包括阳性参考品6份、阴性参考品10份、重复性参考品1份和检测限参考品3份。参考品均匀性变异系数(coefficient of variation,CV)为3.1%,满足行业标准CV≤15.0%的要求;2～8℃放置7 d、室温放置3 d和反复冻融3次对参考品均无影响。质量标准为：阳性符合率应≥4/6,阴性符合率应为10/10,重复性(2个浓度水平)的检测结果应均为阳性且CV均≤15.0%,检测限参考品L1应为阳性,L2～L3不作要求。结论 建立的EB病毒衣壳抗原IgM抗体检测试剂国家参考品可用于相关试剂研发的质量控制及评价。     

综述与专论: 核酸适配体筛选与亲和力评价技术主要研究方向、进展与挑战

核酸适配体是一类具有特异性分子识别能力的单链DNA或者RNA分子,通过指数富集的配体系统进化技术（SELEX）筛选得到。核酸适配体相比抗体具有热稳定性高、便于化学合成与修饰、免疫原性低等优点,在生物分析、生物医学、生物技术等众多领域引起广泛关注。高质量的核酸适配体是应用的基础,然而目前能够满足实际应用的核酸适配体数量还非常有限。如何获得高亲和力、高特异性、高体内稳定性的核酸适配体是核酸适配体领域的技术瓶颈。本文首先简单介绍了SELEX技术的基本原理和核酸库的设计、筛选过程监控、次级文库制备、测序和候选适配体筛选等关键步骤。接着归纳总结了30多年来核酸适配体筛选技术的6个主要研究方向、研究进展和局限性。这6个主要研究方向分别是提高适配体特异性的筛选方法、提高适配体稳定性（抗核酸酶降解能力）的筛选方法、快速筛选方法、复杂靶标适配体筛选方法、小分子靶标适配体筛选方法、提高适配体亲和力的筛选方法。其中快速筛选技术是长期以来持续关注的研究方向,几乎所有物理分离手段都已用于提高SELEX的筛选效率。最近,高效化学反应与SELEX技术的结合为核酸适配体的快速筛选提供了新的策略。本文随后对适合小分子靶标核酸适配体筛选的3类方法进展和存在的问题进行了重点评述。这3类方法分别是基于靶标固定的筛选技术、基于文库固定的筛选技术（捕获-SELEX,Capture-SELEX）和均相筛选技术（氧化石墨烯-SELEX,GO-SELEX）。基于靶标固定的筛选技术尽管存在空间位阻等众多问题,由于其操作的简单性,目前依然应用广泛。近年来Capture-SELEX应用广泛。结合36种靶标适配体的筛选实验条件（文库设计、正筛靶标浓度、负筛靶标的选择和浓度）和所获得的适配体的亲和力（K_D,解离常数,dissociation constant）和特异性,对Capture-SELEX的实验条件与适配体性能的关系进行了讨论。统计数据表明,降低正筛靶标浓度有利于提高适配体的亲和力,但不是必要条件。负筛选是目前提高适配体特异性的主要技术手段,但适配体的特异性还不能满足实际需求。负筛选靶标及其浓度的选择差异很大,而且36种靶标中有20种靶标的适配体筛选没有进行负筛选。如何提高核酸适配体的特异性是目前小分子靶标核酸适配体所面临的难题,急需寻找新的策略。本文还列表归纳了近三年利用GO-SELEX进行的13种小分子靶标的实验条件和所获得的适配体的K_D和特异性。统计数据表明,GO-SELEX比Capture-SELEX所需要的筛选轮数少,两种方法所获得的适配体的亲和力多在纳摩尔每升水平。Capture-SELEX相对较低的筛选效率应该主要由于文库的自解离问题。核酸适配体的亲和力评价是候选核酸适配体结构与性能评价的重要组成部分。常用的核酸适配体亲和力评价技术包括基于分离、基于固定、均相体系三大类十多种方法。假阳性和假阴性是各种评价技术都有可能存在的问题。本文以纳米金比色法和等温热滴定技术为例评述技术进展,讨论导致不同亲和力评价技术结果不一致性问题的根本原因。本文最后对核酸适配体筛选技术、亲和力评价技术和技术的标准化的未来发展趋势进行了展望。