静脉注射41BBLGFP融合表达质粒体内表达及其生物学活性

通过RTPCR方法扩增小鼠41BBLcDNA,以pEGFPN1为载体,构建融合蛋白41BBLGFP重组表达质粒p41BBLGFP.采用基于流体力学原理建立的裸DNA体内转染技术,从小鼠尾静脉快速(15s)注射质粒p41BBLGFP进行体内转染.荧光显微镜观察组织切片,见小鼠肝、脾、肾及肺中均有报告基因GFP表达,尤以肝细胞中荧光最强.进一步用Western印迹和免疫组织化学染色法确定肝细胞表面表达41BBL,用Hsp70H22细胞抗原肽皮下免疫小鼠,同时尾静脉注射质粒p41BBLGFP,检测血清中IL2和IFNγ的分泌.结果显示,质粒注射联合免疫组小鼠血清IL2和IFNγ的浓度分别较生理盐水对照组增加了3倍和4倍;脾细胞对H22细胞的杀伤率则由单独免疫组的45.74%±3.27%增至86.74%±9.36%.结果表明,体内(主要在肝脏)转染质粒p41BBLGFP可以成功表达,表达产物具有41BBL的生物学活性,为进一步研究体内转染41BBL用于基因治疗奠定了基础.     

一株牛蛙源金黄杆菌的分离鉴定及其致病特性

【背景】美国牛蛙养殖过程中病害问题非常突出,尤其是细菌性病害,其病原种类多、病原菌复杂多样、蔓延速度快、发病死亡率高,一直是牛蛙养殖过程中防控的难点。【目的】确定从患病牛蛙体内分离到的一株细菌NW1203的分类地位和致病性。【方法】无菌操作从牛蛙体内取样划线分离细菌,通过形态观察、生理生化试验、16S rRNA基因序列比对进行种属鉴定,通过人工感染、溶血性试验和病理切片观察分析其致病特性。【结果】经形态和生理生化鉴定及16S rRNA基因序列比对,菌株NW1203为金黄杆菌属细菌,与Chryseobacterium sp. F30的相似性达100%,进化树也显示该菌与金黄杆菌属细菌聚类;溶血性试验表明,菌株NW1203对绵羊、小鼠和牛蛙的血细胞都呈完全溶血;人工感染试验及感染病蛙的组织切片观察显示,菌株NW1203对牛蛙具有较强致病性,可引起牛蛙肝、肾、脾等主要组织严重病变,LD50为4.753×103 CFU/g。【结论】明确了菌株NW1203为牛蛙新病原,为牛蛙疾病的防控提供了理论依据。     

链霉菌分化调控启动子——PTH4和PTH270的体内转录研究

天蓝色链霉菌分化调控启动子P_TH4和P_TH270被分别亚克隆到链霉菌启动子探针载体pIJ4083后,构建的重组质粒被命名为pIJ4470和pIJ4471.当pIJ4470和pIJ4471转化天蓝色链霉菌的白色分化阻断突变株(C85,C70,C71,C17和C119)后,通过pIJ4083上儿茶酚加氧酶报告基因的表达可知启动子的活性.从构建的重组菌株中进行了总RNA的提取.用同位素标记P_TH4和P_TH270的5’-端制备成了探针,以不同来源的RNA为模板与制备的探针分别进行了DNA-RNA杂交.S1 mapping的结果表明,来自C85/pIJ4470,C85/pIJ4471,C70/pIJ4470,C70/pIJ4471及C17/pIJ4470,C17/pIJ4471菌株的RNA杂交后都给出了较强的阳性杂交信号,而来自C71/pIJ4470,C71/pIJ4471菌株的RNA杂交未出现阳性信号,来自C119/pIJ4470与C119/pIJ4471菌株的RNA杂交后有弱的信号.上述结果表明启动子P_TH4和P_TH270的转录依赖于链霉菌分化关键基因whiG,部分依赖于分化基因whiH,而不依赖于分化基因whiA,whiB及whiI.     

重组TFPI缺失突变体TFPI1-161在毕赤酵母中的高效表达及功能鉴定

人组织因子途径抑制物 (TFPI)是一种体内天然存在的外源性凝血途径特异性抑制物。缺失突变体TFPI_1-161仅包括TFPI的N末端、K1和K2结构域 ,是一种研究TFPI结构与功能及其相互关系的理想对照分子。以克隆质粒Pgem 3Zf(-) TFPI为模板 ,用PCR方法获得TFPI_1-161 基因 ,构建表达质粒Ppic9k TFPI_1-161并转化毕赤酵母GS115。通过筛选多拷贝转化子及优化发酵培养条件 ,首次在毕赤酵母中高效表达了TFPI_1-161,经纯化后最终产量高于酿酒酵母 20倍以上。由于糖基化程度不同 ,TFPI_1-161 表达为TFPI1_1-161 (2 4kD)和TFPI_1-161 (27kD)两种分子形式 ,其等电点分别为 4.8和 4.9。根据等电点差异 ,二者可通过阴离子交换层析得到分离 ,其活性无显著性差异。经分子筛和阴离子交换层析分离纯化后 ,从 4L发酵培养液中可分别获得 1.4gTFPI_1-161(2.4kD)和1.8gTFPI_1-161 (2.7kD) ,其比活性分别达12880u/mg和12400u/mg.回收率达55%.经稀释的凝血酶原时间及发色底物法检测,重组FTPI_1-161具有良好的抗凝及抑制Fxa活性的作用。为获得大量TFPI_1-161提供了一种廉价高效的的蛋白表达纯化方式。为进一步的基础及临床前研究奠定了基础。     

富氢盐水对高压电烧伤大鼠微循环内红细胞流速及组织病理损伤的影响

目的:探讨富氢盐水对高压电烧伤大鼠微循环内红细胞流速及组织病理损伤的影响。方法:80只大鼠随机分为四组,分别为烧伤组、治疗组、对照组和阳性对照组,治疗组烧伤后给予富氢盐水治疗,阳性对照组给予罂粟碱溶液治疗。每组分成三个亚组用于血气分析,肺组织形态学观察和红细胞流动速度检测。结果:治疗组和阳性对照组大鼠肺组织湿干重比均显著低于烧伤组(P0.05),治疗组和阳性对照组大鼠肺组织湿干重比差异不显著(t=0.585,P0.05)。治疗组和阳性对照组大鼠生存时间均显著高于烧伤组(P0.05),治疗组和阳性对照组大鼠生存时间差异不显著(t=0.448,P0.05)。治疗组和阳性对照组氧分压均显著高于烧伤组(P0.05);治疗组和阳性对照组氧分压差异不显著(t=0.424,P0.05)。治疗组和阳性对照组二氧化碳分压均显著低于烧伤组(P0.05);治疗组和阳性对照组二氧化碳分压差异不显著(t=1.285,P0.05)。治疗组和阳性对照组大鼠红细胞流动速度分压均显著高于烧伤组(P0.05);治疗组和阳性对照组之间大鼠红细胞流动速度差异不显著(P0.05)。结论:富氢盐水能够促进烧伤大鼠微循环内红细胞的流动,改善微循环,恢复受损肺组织,在高压电烧伤患者的治疗方面具有较好的应用前景。     

巨噬细胞极性重塑在疾病和组织稳态中的作用

巨噬细胞是最重要的固有免疫细胞之一,极化和可塑性是其显著特征。这使巨噬细胞在应对微环境信号和刺激时可以极化为与局部环境相匹配的特征、表型和功能,从而更准确地调节组织稳态,极化和可塑性失调往往与多种疾病的发生、发展密切相关。然而巨噬细胞极性和可塑性调节在多种生理、病理过程中的作用还不十分清楚,有待梳理总结。因此该文以感染、炎症、肿瘤、慢性病等病理过程和组织修复、衰老和妊娠等正常生理过程为切入点,阐述巨噬细胞极性重塑在其中的关键作用和特征性分子,从新的维度描绘巨噬细胞极性重塑在健康和疾病发生中的全景图,旨在明确巨噬细胞极性重塑的全部谱系分子,揭示极性重塑的信号网络和解析极性重塑的分子机制是该领域未来工作的热点,该文有望以巨噬细胞极性重塑为核心开发一系列药物和干预手段,为感染、炎症、肿瘤、慢性病的治疗提供新策略。     

组织激肽释放酶在肿瘤发展中的作用

组织激肽释放酶(kallikrein-related peptidases,KLKs)是人类基因组中已知最大的丝氨酸蛋白酶家族。KLKs主要存在于体液和组织中,参与了广泛的生理过程,它们的异常调节与肿瘤的发生发展密切相关。该文总结了KLKs参与肿瘤发生发展的相关机制,以及部分KLKs成员在肿瘤发展进程中发挥的重要作用,综述了它们所介导的肿瘤发展进程以及作为肿瘤生物标志物和候选治疗靶点的研究进展。     

生长因子在肌腱再生中的应用

肌腱损伤是一个全球性的常见健康问题,肌腱的特性使得肌腱的愈合变得十分困难,损伤部位愈合后常常被疤痕组织替代,造成肌腱生物力学性质的损害。近年来,许多证据表明生长因子能够促进肌腱的再生愈合,这为治疗肌腱损伤开辟了新的方向。该文主要总结了近年来用于治疗肌腱损伤的相关生长因子及其对肌腱损伤的治疗作用和递送方法。阐明了未来可能通过生长因子、干细胞和生物支架的联合应用的组织工程的方法实现肌腱疤痕的消除及肌腱个体化再生。     

涡虫再生的诱发机制

组织再生由复杂的基因网络调控,但基因调控网络的上游诱发机制仍有待进一步明确。解剖结构、基因组以及系统进化位置上的特征使具有全身再生能力的涡虫成为探究再生问题的良好动物模型之一。研究涡虫再生的诱发机制对于解释物种间再生能力的差异,以及促进再生调控具有重要意义。研究发现涡虫受损后,一些再生早期信号的快速响应是下游再生基因调控网络激活及组织正常再生的潜在诱发条件,包括离子通道通过介导离子流引起胞内外离子浓度改变而诱导干细胞增殖;活性氧与细胞外信号调节激酶的相互作用可激活下游调控组织分化的信号通路;ATP可能通过激活嘌呤能受体调控下游再生过程;损伤后产生的大量黏液及一氧化氮可能作为信号因子,通过免疫相关作用引发再生相关信号级联反应;神经和表皮间的相互作用可能诱发芽基生成及后续再生过程。不同因素可能通过参与再生微环境的塑造,协同激活再生基因调控网络,促进涡虫再生。这些潜在的再生激活因素与涡虫强大的再生能力之间的确切关系,以及再生激活因素与诱发伤口愈合因素的异同目前仍不明晰,需要进一步探究。     

接种方式对细胞在三维材料中接种率和分布的影响

考察了静态和动态接种方式对成纤维细胞在胶原壳聚糖支架材料中接种率和分布的影响。将人成纤维细胞制成细胞悬液,分别采用静态接种、转瓶接种和灌注接种方式将细胞接入三维胶原壳聚糖海绵。通过MTT法和切片HE染色分别考察细胞接种率及细胞在三维材料中的分布。实验结果表明：在低的接种密度下静态接种有较高的接种率(889%),但随着接种密度的增加接种率下降显著,细胞结团且分布不均匀;转瓶接种的接种率约为60%,细胞分布也不均匀;灌注接种的接种率始终维持在77%以上,能得到高的起始细胞密度,且细胞分布均匀,是一种理想的接种方式。细胞接种方式的优化为改善工程化组织的结构和功能、缩短体外构建时间奠定了基础。