寄生曲霉脂肪酶的全基因合成、原核表达及其结构分析

根据寄生曲霉脂肪酶基因序列(GenBank登录号:AF404488)及大肠杆菌密码子的偏爱性,应用重叠延伸PCR技术,人工合成了寄生曲霉脂肪酶基因lipAP.将基因克隆到pFL-B13cl载体上获得重组质粒pFL-B13cl/Lip AP,并在大肠杆菌BL21(DE3)中进行优化表达.融合蛋白Sumo-LipAP在0.1 mmol/L IPTG、37℃条件下诱导6 h表达量最高.SDS-PAGE分析显示融合蛋白His-Sumo-LipAP以包涵体形式表达,大小约为53 kD.复性后透析处理,大部分融合蛋白转化为正确构象且具有催化活性,经一步疏水层析其纯度可达98％.生物信息学工具预测和分析发现,LipAP空间结构保守,具有催化三联体(Ser173-Asp226-His288)、活性部位盖子(S111YSIRNWVTDAT122)及保守五肽(GHSLG)3个功能域.     

拟除虫菊酯农药降解菌HP-S-01培养基的筛选及优化

通过比较高氏合成1号培养基、查彼氏培养基、马铃薯葡萄糖培养基、燕麦片培养基和理查德培养基等5种培养基对拟除虫菊酯农药降解菌Streptomyces sp.HP-S-01生长的影响,确定了高氏合成1号培养基为菌株生长最适宜的培养基.以高氏合成1号培养基为基础培养基,采用中心组分旋转设计法(RRCD)和响应曲面法(RSM),优化了培养基关键组分中可溶性淀粉、硝酸钾和磷酸氢二钾的组成,以降解率为主要衡量指标,最佳配方包括可溶性淀粉25.9549 g/L、硝酸钾1.9975 g/L和磷酸氢二钾0.9505 g/L,最终优化出的培养基处理1 d后对50 mg/L高效氯氰菊酯的降解率达到99.61%,与期望降解率99.92%相一致,比优化前84.10%提高了15.51%.     

大豆根瘤菌HH103菌株培养基的筛选与优化

以快生型大豆根瘤菌HH103菌株为供试菌株,采用单因素碳氮源利用试验和正交设计试验,确定最佳培养基及其配方。结果表明：该菌株在YMA中生长良好,最佳碳源为蔗糖,最佳氮源为酵母膏,最佳培养基成分配方（g/L）：蔗糖11,酵母膏0.9,K2HPO4 0.5,MnSO4 0.005,CaCl2 0.1,KH2PO4 0.5,MgSO4 0.2,KNO30.77,（NH4）2HPO4 0.33,FeCl3 0.005,pH 7.2。     

甜叶菊RAPD反应体系的优化

以甜叶菊为试材,对影响其RAPD反应体系的7个因子进行优化.结果表明,20 μL的优化体系包括:双蒸水13.6 μL,10×Buffer(含15 mmol/L MgCI2)溶液3μL,2.5 mmol/L的dNTPS 1.2 μL,10 μmol/L的引物1μL,20 ng的模板DNA 1μL,1UTaq聚合酶;热循环...     

蛛丝蛋白基因在大肠杆菌中表达研究

利用大腹园蛛基因组文库筛选获得一段693 bp基因片段,经分析该段基因处于鞭毛状丝基因重复区域,且其中包含了一个完整的重复框架。通过基因密码子优化,在其3′和5′端分别融合蛋白质亲和层析标签,克隆于pET30LIC表达载体中,在不同的大肠杆菌中进行表达试验。实验结果显示:经过密码子优化,融合目的蛋白基因在BL21(DE3)中得到了高效表达,产量达到25~30mg/L,纯化产物纯度达90%以上。SDS-PAGE和W estern-b lotting检测目的融合蛋白均与预期蛋白大小一致。     

红树植物秋茄叶片双向电泳技术体系的建立及优化

对适用于秋茄(Kandelia candel)叶片蛋白质组学研究的双向电泳技术体系进行了优化.结果表明,采用酚抽提法提取的蛋白质浓度较低,约1.7 μg μL-1,SDS-PAGE电泳后几乎无条带;而采用改良TCA -丙酮沉淀法可显著提高提取液中蛋白质的含量,可达12.4 μgμL-1.秋茄叶片蛋白质主要分布在pH4～...     

猴源细小病毒血凝和血凝抑制试验的优化与应用

目的优化猴源细小病毒的血凝和血凝抑制（HA/HI）试验条件,以优化的方法对160份2010年～2011年间采集于中国北京地区圈养猴群的血清样品进行猴源细小病毒抗体调查。方法 在不同的缓冲液、缓冲液pH值、猪红细胞浓度、兔血清浓度、阿氏液比例和温度下进行猴源细小病毒的HA/HI试验,选择合适的HA/HI条件。通过优化的HA/HI方法对160份猴血清进行猴源细小病毒抗体检测。结果pH 7.0、0.02 mol/L PBS、0.75%猪红细胞、0.5%兔血清和4℃可作为猴源细小病毒HA/HI试验合适的反应条件,猪血球以1∶1阿氏液抗凝,可保存5～7 d不影响实验结果。猴血清的猴源细小病毒抗体阳性率为58.1%。结论方法优化后稳定性增强、检测时间缩短、准确性提高。细小病毒在我国北京地区圈养猴群中感染比较普遍。     

缢蛏SRAP-PCR体系的正交优化

运用L16(45)正交设计对影响缢蛏SRAP-PCR反应的5个因素:Taq酶浓度、Mg2+浓度、模板DNA浓度、dNTPs浓度和引物浓度在4个水平上进行了优化试验,PCR结果采用SPSS v16.0软件分析.结果表明,各因素对SRAP-PCR反应的影响依次为:引物>Taq酶>模板DNA>Mg2+;缢蛏SRAP反应最佳体系为:在20μL PCR反应体系中,引物0.3 μmol/L、Taq 酶0.5 U、模板DNA 50 ng、dNTPs 0.2 mmol/L及Mg2+2 mmol/L.用不同缢蛏的基因组DNA两次SRAP-PCR扩增,8对引物均能扩增出清晰且重复性好的谱带.因而建立的缢蛏反应体系稳定可靠.     

pBV220/hIL-4优化表达及其包涵体复性研究

旨在对人白细胞介素-4(hIL-4)上、下游序列进行优化设计,提高在原核系统中的表达量,并对表达的包涵体进行复性研究提高复性率.利用BioSun的RNA二级结构预测模块辅助设计hIL-4起始密码子(AuG)上、下游的序列,使局部二级结构的自由能满足高表达要求;根据pBV220栽体和原核系统的特点优化引物序列提高hIL-4原核表达量.优化hIL-4包涵体复性条件和方法,提高复性率和生物活性.结果显示,成功构建了pBV220/hIL-4高效表达栽体,原核表达的重组人IL-4占细茵总蛋白的35%以上,明显高于优化前表达量;经过复性研究hIL-4包涵体复性率可达到15%以上,生物活性鉴定发现,纯化的hhIL-4蛋白的比活等同或高于国外同类产品.影响原核表达的条件较多,对表达序列的优化设计可以大大提高蛋白的表达量.针对人IL-4基因序列的优化设计提高了人IL-4基因的表达,复性方法的改良提高了复性率和生物活性.     

纳豆激酶固态发酵的参数优化

方法:在对实验室分离的纳豆激酶产生菌进行菌株鉴定及其酶学性质研究的基础上,对影响菌株固态发酵产酶的工艺参数进行了优化研究.结果:发酵温度、发酵时间及培养基碳氮比、料水比、pH对纳豆激酶的产生都有较大影响,而接种量对纳豆激酶影响较小;在优化条件下,纳豆激酶固态发酵酶活可达到8 300U/g,为已知最高纳豆激酶单位酶活.