冠状病毒反向遗传技术的研究进展和应用

冠状病毒（Coronavirus,CoV）在分类上属于尼多病毒目、冠状病毒科、冠状病毒属,其基因组长度约为25 000 nt～30 000 nt。反向遗传技术可以针对RNA病毒的基因组进行突变,是研究病毒蛋白功能的有力工具,也是对毒力基因进行突变,构建减毒疫苗株的新型方法。冠状病毒反向遗传技术的建立和应用,推动了基因功能的研究和重组病毒疫苗的研发。本综述将介绍三种常见的冠状病毒反向遗传克隆技术,分别是基于痘病毒载体、基于细菌人工染色体（Bacterial artificial chromosome,BAC）载体和基于体外连接的反向遗传技术。传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）是成功建立反向遗传系统的冠状病毒之一,本文对反向遗传技术在IBV中的研究和应用进行了介绍和讨论。     

宿主miRNA参与甲型流感病毒复制调控研究进展

流行性感冒（简称“流感”）是由流感病毒引起的急性呼吸道传染疾病,据世界卫生组织统计,流感每年可导致300万～500万严重病例,其中29万～65万病例死亡,给社会带来沉重的经济负担,是一个世界性的公共卫生难题。研究发现宿主细胞中存在多条信号通路参与对流感病毒感染的应答,越来越多的研究表明宿主miRNAs通过直接或间接的方式,在流感病毒感染、复制的不同阶段发挥着重要调控作用。本文综合分析了目前关于宿主细胞miRNA对流感病毒复制调控的研究进展,对不同的miRNA具体的调控机制进行系统地归类总结后发现：甲型流感病毒（Influenza A virus,IAV）的PB1、PB2、NA、NP、M1基因是宿主miRNA直接抑制病毒复制的主要靶基因,而在间接调控过程中宿主miRNA主要作用在RIG-I样受体信号通路,Jak-STAT信号通路和Toll样受体信号通路三条流感病毒应答信号途径中,以上发现将更有助于全面理解宿主miRNA对于流感病毒调控网络和宿主细胞与流感病毒的互作机制。     

塞内卡病毒A结构蛋白VP2诱导PK-15细胞自噬的研究

本研究在塞内卡病毒A(Senecavirus A,SVA)诱导自噬的基础上,着重探究VP2蛋白在细胞自噬过程中的作用。构建VP2基因真核表达载体pcDNA3.1-VP2,将其转染至PK-15细胞,通过检测自噬蛋白和相关基因的表达情况,明确VP2蛋白对细胞自噬的影响。结果显示,本研究成功构建了pcDNA3.1-VP2真核表达载体,且SVA VP2基因在PK-15细胞中正常表达;与对照组相比,VP2蛋白显著上调LC3蛋白的表达水平（P<0.01）;同时,自噬基因LC3、Beclin-1和ATG5转录水平均显著提高（P<0.01）。综上所述,本研究证实SVA VP2蛋白可诱导PK-15细胞自噬,且VP2蛋白与自噬蛋白和基因表达水平呈正相关,为进一步研究病毒感染与致病机制打下基础。     

柯萨奇病毒A组9型的基因分型方法的建立

血清型别鉴定及基因分型分析是开展肠道病毒（Enterovirus,EV）分子进化特征研究的重要内容。目前为止,国内外对柯萨奇病毒A组9型（Coxsackievirus A9,CVA9）的研究主要集中在衣壳蛋白区的细胞受体结合位点及其基因特性分析,而基于全长VP1序列的基因型划分结果尚未明确。本研究依托国家手足口病监测网络,对2010-2019年全国31个省级行政区（省、自治区、直辖市）上送的18 238份手足口病样本中分离出的24株CVA9进行全长VP1区序列测定,并与GenBank中所有全长VP1区序列一起进行基因型划分研究。测序结果显示24株CVA9分离株VP1全长为906bp,编码302个氨基酸,与CVA9原型株（Griggs）核苷酸和氨基酸相似性分别为80.5%～97.6%和92.3%～99.6%。结合系统进化树和同一血清型内不同基因型的核苷酸差异界值为15%～25%,将全球CVA9划分为A-H八个基因型。进化树显示B、C和D基因型在病毒进化过程中已消失,而E、F和G基因型呈现共循环的趋势,其中G基因型包含了亚洲、北美洲、大洋洲和欧洲等9个国家的毒株,是CVA9的优势基因型。大...     

柯萨奇病毒A组4型生物化学特性及免疫原性分析

对引起手足口病的肠道病毒A组4型进行生物化学特性及免疫原性的研究。利用大肠杆菌表达结构蛋白全长或部分片段的GST融合蛋白,纯化CV-A4病毒颗粒,制备兔抗CV-A4 VP1～VP4蛋白及抗CV-A4病毒颗粒抗血清。以免疫印迹法（Western blotting,WB）,结合SDS-PAGE电泳法,对CsCl密度梯度纯化的CV-A4的空心颗粒（EP）与实心颗粒（FP）的蛋白组分、纯度、多聚蛋白酶剪切进行分析。以微量中和法测定以上6种抗原免疫的兔或小鼠血清中和抗体效价,评估免疫原性。WB和间接免疫荧光法证明了抗体特异性。EP由VP0、VP1和VP3构成,而FP的VP0被剪切,故由VP1-VP4构成。EP和FP比例分别为41%和59%。CsCl密度分别为1.26 g/cm3和1.34 g/cm3,纯度分别为70.5%和96.3%。中和试验显示,兔抗全病毒抗体具有中和作用,而兔抗CV-A4VP1～VP4结构蛋白抗体不具有中和作用。免疫原性强弱为：FP>EP>VP1-VP4。本研究建立了CV-A4纯化病毒结构蛋白的分析方法,研究了重组病毒蛋白及2种病毒颗粒的免疫原性及免疫持久性。对包...     

异钩藤碱调控ERK/p27^(Kip1)信号通路改善博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化CSCD

基于细胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)、p27^(Kip1)信号通路探究异钩藤碱(isorhynchophylline,IRN)对博莱霉素(bleomycin,BLM)诱导的小鼠肺纤维化(pulmonary fibrosis,PF)的作用及机制。C57BL/6J小鼠48只,随机正常组、BLM组、BLM+IRN(10、20 mg/kg)两个剂量组,每组12只。气管注射BLM(5000 U/kg)诱导PF小鼠模型,造模后连续灌胃给药21天。HE和Masson染色观察肺组织病理变化及胶原沉积情况。免疫组化检测肺组织α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)的表达。体外培养小鼠原代肺成纤维细胞,实验设对照组、转化生长因子-β1(transforming growth factor-beta 1,TGF-β1)(10 ng/mL)组和TGF-β1+IRN(5、10、20μmol/L)三个剂量组。EdU掺入法和流式细胞术检测细胞增殖,Transwell观察细胞的迁移能力。RT-qPCR检测肺组织或肺成纤维细胞TGF-β1、collagen I和α-SMA mRNA的表达。Western blot检测肺组织和(或)肺成纤维细胞TGF-β1、collagen I、α-SMA、p-ERK1/2,p27^(Kip1)、CDK2和Cyclin E1的蛋白水平。动物实验结果显示,与BLM组相比,不同剂量IRN均能明显减轻肺组织结构的损伤、降低炎症细胞的浸润和胶原的沉积;此外,IRN不同程度地降低肺组织TGF-β1、collagen I和α-SMA mRNA和蛋白的表达;同时,IRN还抑制了肺组织ERK1/2的磷酸化、上调p27^(Kip1)和下调CDK2和Cyclin E1的蛋白表达。细胞实验结果显示,与TGF-β1组相比,不同剂量IRN能够明显抑制TGF-β1诱导的肺成纤维细胞增殖、显著降低细胞迁移能力;明显降低TGF-β1诱导的collagen I和α-SMA mRNA和蛋白的表达,同时降低ERK1/2的磷酸化水平、上调p27^(Kip1)和下调CDK2和Cyclin E1的蛋白表达。以上结果表明IRN可能通过抑制ERK1/2信号通路、上调p27^(Kip1)的表达而抑制了肺成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化,从而减轻了BLM诱导的PF。     

古尔班通古特沙漠固定沙丘上白梭梭和梭梭的空间分布及种间关联性

为了探讨沙漠中固沙灌木种群共存和演替机制, 本文基于古尔班通古特沙漠东南缘固定沙丘上白梭梭(Haloxylon persicum)和梭梭(H. ammodendron)种群的地理位置和生长发育阶段信息(幼株、营养株、生殖株和死株), 采用点格局分析方法(g(r)函数)及Monte-Carlo随机模拟检验和零模型选取的方法, 分析了固沙灌木白梭梭和梭梭种群不同生长发育阶段在0-20 m尺度内的空间分布格局及种间关联性。结果表明: (1)两个种群在研究尺度范围内呈聚集分布, 随着尺度的增大, 其聚集强度逐渐减弱; (2)两个种群整体上呈负关联关系, 尺度越大负关联关系越显著; (3)白梭梭种群生长发育阶段相差越大, 个体间正关联关系越显著; 梭梭种群生长发育阶段越接近, 个体间正关联关系越显著; (4)两个种群中龄级较大的个体(如营养株、生殖株和死株)会对对方种群中龄级较小的幼株产生一定的抑制作用; 同时, 随着两个种群中个体的成长, 双方受到的抑制作用逐渐减弱, 主要表现为正关联和无关联。总体而言, 古尔班通古特沙漠固定沙丘白梭梭和梭梭种群的分布格局整体上为聚集分布, 随龄级增加聚集性减弱, 受生境异质性和扩散限制的影响明显。种间关系多为负相关, 种内不同生长发育阶段之间均为正关联关系。     

中国生物多样性核心监测指标遥感产品体系构建与思考

生物多样性的稳定维持关乎人类生存发展与地球健康。生物多样性核心监测指标(Essential Biodiversity Variables, EBVs)旨在结合地面调查与遥感技术, 为大尺度、长时间序列的生物多样性监测提供新的解决方案。然而, 目前学界仍然缺乏一套国家尺度标准化EBVs遥感监测产品数据集, 以进行生物多样性评估。本研究旨在对中国生物多样性核心监测指标遥感产品进行体系构建与思考, 首先综述了目前EBVs的遥感研究概况, 并根据EBVs研究文献的数量进行调研分析; 同时, 本文在已有遥感生物多样性产品优先标准的基础上, 添加了“可重复性”的新标准, 并据此构建了中国EBVs遥感产品体系与监测数据集的指标清单, 最终对中国EBVs遥感研究存在的问题进行思考与讨论。本研究可为中国的生物多样性遥感监测提供科学依据, 有望为中国生物多样性政策的制定提供支撑。     

乙型肝炎病毒X蛋白上调环加氧酶2表达促进肝癌细胞增殖的实验研究

乙肝病毒X蛋白（Hepatitis B virus X protein,HBx）高表达与乙肝相关肝癌的发病密切相关,但HBx发挥促癌作用的机制并不清楚。环加氧酶2（Cyclooxygenase,COX2）具有促进肝癌细胞增殖的功能,乙肝相关肝癌中COX2的表达增加且与HBx呈正相关,提示上调COX2可能是HBx促进肝癌细胞增殖的分子机制。为了阐明HBx是否通过上调COX2促进肝癌细胞增殖,本实验培养了肝癌HepG2细胞并分为对照组、转染pcDNA3.1-HBx质粒的HBx组、转染NC siRNA的si-NC组、转染NC siRNA及pcDNA3.1-HBx质粒的si-NC+HBx组、转染COX2 siRNA及pcDNA3.1-HBx质粒的si-COX2+HBx组。检测细胞增殖活力OD_490nm的水平,COX2、B淋巴细胞瘤2基因（BCL2）、生存素（Survivin）的表达量,前列腺素E2（英文名,PGE2）的含量。实验结果显示,HBx组的OD_490nm水平,细胞中COX2、BCL2、Survivin的表达量,培养基中PGE2的含量均高于对照...     

广东丹霞山国家级自然保护区 蝙蝠物种多样性调查

于2017年至2018年对广东丹霞山国家级自然保护区的翼手目动物进行调查,主要采用日栖息地与夜栖息地、捕食区网捕等调查方法,共调查到翼手目5科13属23种,其中蝙蝠科(Vespertilionidae)9属15种,菊头蝠科(Rhinolophidae)1属4种,蹄蝠科(Hipposideridae)1属2种,假吸血蝠科(Megadermatidae)1属1种,犬吻蝠科(Molossidae)1属1种。从区系组成来看,以东洋界为主(19种),其次为广布种(3种),古北界仅1种。从栖息类型上看,分为洞栖型、树栖型及建筑物栖息型,以洞栖型为主(15种),建筑物栖息型其次(12种),树栖型最少(5种),但其中9个物种的栖息地类型同时包含了上述3种栖息类型中的2种。本研究在广东丹霞山发现中国蝙蝠新分布记录1种,为卡氏伏翼(Hypsugo cadornae);而中印鼠耳蝠(Myotis indochinensis)为中国分布的再次确认。