Identification and characterization of new plant microRNAs using EST analysis

Seventy-five previously known plant microRNAs (miRNAs) were classified into 14 families according to their gene sequence identity. A total of 18,694 plant expressed sequence tags (EST) were found in the GenBank EST databases by comparing all previously known Arabidopsis miRNAs to GenBank‘s plant EST databases with BLAST algorithms. After removing the EST sequences with high numbers (more than 2) of mismatched nucleotides, a total of 812 EST contigs were identified. After predicting and scoring the RNA secondary structure of the 812 EST sequences using mFold software, 338 new potential miRNAs were identified in 60 plant species, miRNAs are widespread. Some microRNAsmay highly conserve in the plant kingdom, and they may have the same ancestor in very early evolution. There is no nucleotide substitution in most miRNAs among many plant species. Some of the new identified potential miRNAs may be induced and regulated by environmental biotic and abiotic stresses. Some may be preferentially expressed in specific tissues, and are regulated by developmental switching. These findings suggest that EST analysis is a good alternative strategy for identifying new miRNA candidates, their targets, and other genes. A large number of miRNAs exist in different plant species and play important roles in plant developmental switching and plant responses to environmental abiotic and biotic stresses as well as signal transduction. Environmental stresses and developmental switching may be the signals for synthesis and regulation of miRNAs in plants. A model for miRNA induction and expression, and gene regulation by miRNA is hypothesized.     

细胞间粘附分子1特异结合肽的筛选及其生物功能

采用两种方法对噬菌体展示随机十五肽库进行亲和淘选 .ELISA法筛选特异结合高亲和力的阳性噬菌体单克隆 ,测序 ,得到 6个与人细胞间粘附分子 1(ICAM 1)高亲和力的噬菌体展示十五肽单克隆 .再经ELISA法从这 6个噬菌体单克隆中选择与ICAM 1亲和力最高的单克隆 ,同时利用蛋白空间结构位象模拟技术对小肽与ICAM 1的亲和力进行模拟研究 .最终获取目的小肽的氨基酸序列为GRGEFRGRDNSVSVV .目的单克隆噬菌体与ICAM - 1的亲和常数Ka 为 7 87× 10 7L mol .体外合成、纯化并标记目的小肽 .ELISA法验证目的小肽与人ICAM 1的结合呈浓度依赖性 ,抗ICAM 1多抗不能拮抗目的小肽与ICAM 1的结合 .采用免疫组化方法证实 ,此目的小肽具有与炎症组织中高表达的ICAM 1特异性结合的功能 .在动物体内 ,荧光标记的目的小肽具有向高表达ICAM 1的炎症部位特异性聚集的功能 .说明此目的肽可尝试作为以ICAM 1为靶的“肽导向药物”的前导肽 .     

亲和标签在重组蛋白表达与纯化中的应用

亲和标签融合技术为重组蛋白的纯化提供了一种简单方便的纯化工具,具有结合特异性高、洗脱条件温和、通用性强、纯化倍数高等显著优点。概述了亲和标签对融合蛋白表达的影响,可以提高重组蛋白的产量,增强重组蛋白的可溶性,促进重组蛋白的正确折叠;回顾了在重组蛋白表达与纯化中广泛使用的几种亲和标签,以及近年来相继出现的几种比较新颖的纯化标签;介绍了亲和标签的组合使用策略,His6-MBP组合标签集合了两个标签的优点,串联亲和纯化可以纯化获得生理条件下的蛋白质复合体;展望了亲和标签未来的发展趋势,认为仍需继续开发性能更加优越、纯化效果更加显著的纯化标签系统。     

利用蛋白质组学手段鉴定新型贻贝足丝蛋白

贻贝通过足腺分泌特有的足丝并以此粘附于水下各种基质表面.贻贝足丝中富含各种粘附蛋白,其优异的水下粘附性能使其成为开发新型生物粘合剂的候选分子.厚壳贻贝足丝粘附能力强,本文采用尿素及盐酸胍抽提结合二维双向电泳技术（two-dimensional electrophoresis, 2-DE）,分别对厚壳贻贝足丝纤维和足丝盘的蛋白质进行分离及染色;采用串联质谱技术结合常规搜库和表达序列标签（EST) 数据库搜索,对分离获得的蛋白质点进行鉴定,从中获得了mfp-3、mfp-6、胶原蛋白以及3种未曾报道过的新型贻贝足丝蛋白成分.上述研究为深入了解厚壳贻贝足丝蛋白的分子多样性、探讨其粘附机理以及从中筛选具有应用前景的贻贝足丝蛋白奠定了基础.     

热胁迫下中甸角蒿叶片SSH文库的构建及初步分析

高温可能是限制中甸角蒿（Incarvillea zhongdiannensis）向低海拔地区引种驯化的主要因素之一。为了从基因表达水平研究中甸角蒿高温胁迫响应的分子机制,本研究利用SSH技术构建了中甸角蒿对高温（30℃）处理响应的正反向抑制性差减杂交文库。文库质量检测表明抑制性差减杂交效率较高,质量较好。通过对正反向文库中部分EST进行序列测定,获得了60条高质量的表达序列标签,平均长度为537bp。对序列进行BLAST比对及功能注释,50条EST为功能已知的基因,分别参与信号转导与转录、植物抗逆性反应、光合作用、代谢与能量、蛋白质合成与转运、蛋白质命运、细胞结构和细胞生长等过程。6个EST与功能未知基因的同源性较高。获得的4个未匹配的EST推测为新基因,可能在植物热耐受性方面具有重要的作用。     

葡萄基因电子表达分析平台的验证与应用

为了验证作者建立的葡萄(Vitis vinifera L.)基因电子表达分析平台在葡萄果实发育相关基因的表达预测及特定序列快速检索等方面的应用效果,利用NCBI上公布的大量葡萄EST序列及半定量PCR和RT-PCR技术,对葡萄不同器官中VvANR、VvCHI、VvCHS2和VvDFR基因的表达分析预测结果进行验证,并对该平台具有的特定序列快速检索功能进行了简介.预测结果表明:葡萄各器官中VvANR、VvCHI、VvCHS2和VvDFR基因的无冗余EST序列数量均较多,分别为33条、36条、55条和46条;4个基因的表达量有一定差异,VvANR在花序和芽中表达量较高,VvCHI在花序、果实和芽中表达量较高,VvCHS2在果实、芽、花序和花中表达量较高,VvDFR在花序、芽、花、果实和根中表达量均较高.半定量PCR和RT-PCR实验结果显示:VvANR主要在花序、花和小果中表达;VvCHI主要在小果、花、茎和花序中表达;VvCHS2主要在茎、花序、花和小果中表达;VvDFR在各组织中表达量从高至低依次排序为花、花序、茎、叶、小果、中果、大果.验证结果表明:采用葡萄基因电子表达分析平台识别表达量较高的组织时,平台的预测结果与实验结果基本一致;而在预测一些表达量较低的组织时效果较差.应用该平台、通过5个步骤,可以简便、快速检索出特定组织或特定状况下的特定cDNA文库信息.     

植物抗病虫SSH文库的EST分析

抑制差减杂交技术广泛应用于植物抗病虫(真菌、细菌和线虫)机理研究。本文在归纳出植物抗病虫SSH文库中ESTs的总体情况之基础上,重点分析了表达频率高的抗病、防御和信号转导基因,并展望了SSH的发展前景,有利于认识植物抗病虫分子机理的普遍规律和推广应用该技术。     

胃癌相关新蛋白Raf激酶抑制蛋白相互作用蛋白质的鉴定

Raf激酶抑制蛋白(RKIP)的异常表达在胃癌的发生发展中起重要的作用,为了阐明其作用机制,应用脂质体将RKIP-3xFLAG-pcDNA3.1质粒转染至SGC7901细胞,建立RKIP-3xFLAG高表达的SGC7901细胞;并利用3xFLAG标签的亲和层析技术联合质谱分析,分离、鉴定与RKIP相互作用的蛋白质,并应用免疫共沉淀联合Western-blot进一步验证质谱结果．共鉴定出66个RKIP相互作用蛋白质,功能分类包括蛋白质代谢酶类、生物氧化相关酶类,细胞骨架蛋白、分子伴侣、信号转导相关蛋白、酶解相关蛋白等．并首次证实14-3-3蛋白与RKIP存在相互作用．为阐明RKIP在胃癌发生发展中的作用机制提供了重要的线索,为胃癌的早期诊治及预后监测提供了新的靶点．     

链霉亲和素及其亲和系统的蛋白质进化

链霉亲和素/生物素（Streptavidin/Biotin）体系作为目前已知的最高亲和力作用体系,已在生物学研究中获得广泛应用。本文针对Streptavidin/Biotin和Strep-Tactin/Strep-tag两个相关系统的演化,分别从链霉亲和素蛋白的结构改造、亲和肽标签优化等方面进行了较为详细的归纳。通过对链霉亲和素蛋白各种突变体的优缺点的比较,有助于实际应用中选择合适的Streptavidin突变体。本文通过对链霉亲和素蛋白质进化的综述,可帮助更准确地理解市场上各种链霉亲和素蛋白的功能和用途,并为深入研究链霉亲和素蛋白的进化提供参考。     

我国肺形侧耳栽培菌株交配型分析

为分析我国栽培肺形侧耳的遗传多样性,对肺形侧耳菌株的交配型进行测定,测试的肺形侧耳菌株包括俗称为秀珍菇和凤尾菇的菌株。结果显示,我国栽培的秀珍菇与凤尾菇菌株间可以发生性亲和,属于同一生物学物种,但它们之间的交配型特异性低,36个菌株中只含4种A交配型和3种B交配型,暗示我国栽培的肺形侧耳种质资源基因匮乏。