桔小实蝇幼体及成虫残体DNA条形码识别技术的建立与应用

实蝇类害虫多为国内外检疫对象, 其鉴定识别方法主要依据成虫的外部形态特征, 而传统的形态学识别法对口岸经常截获的幼体及残缺的虫体, 则无能为力。本研究以桔小实蝇Bactrocera dorsalis的幼体（卵、 幼虫、 蛹）以及成虫残体（足、 翅、 头部、 胸部、 腹部）为对象, 利用 DNA 条形码技术, 构建实蝇类害虫快速鉴定技术体系, 并以其他4种常见实蝇（包括番石榴实蝇B. correcta、 瓜实蝇B. cucurbitae、 南亚果实蝇B. tau、 柑桔大实蝇B. minax）为对象对该技术体系进行应用验证。结果显示, 桔小实蝇幼体以及成虫残体的碱基序列与数据库中靶标种COⅠ基因碱基序列的一致性为99.51%~99.84%, 其他4种实蝇相应序列与数据库中靶标种COⅠ基因序列的一致性分别为100%, 100%, 99.81%~99.83%和100%; 以邻接法（NJ法）构建系统发育树, 靶标种实蝇均与数据库中对应种实蝇聚为一支, 且置信度均为100%。以K2-P模型计算种内及种间遗传距离得出, 5种实蝇的种间遗传距离为0.0597~0.2363, 平均为0.1693; 种内遗传距离为0.0000~0.0041, 平均为0.0019。这些结果表明, 基于DNA条形码的物种识别技术完全可用于口岸截获的实蝇类害虫幼体及残体的准确鉴定。     

桔小实蝇V-ATPase G亚基基因的克隆及组织表达特异性分析

空泡型ATP酶（vacuolar-type H⁺-ATPase, V-ATPase）作为质子泵几乎在所有的真核生物细胞中发挥重要作用。本研究利用RT-PCR和RACE技术获得了桔小实蝇Bactrocera dorsalis (Hendel)V-ATPase G亚基序列全长, 命名为BdorATPG。测序结果表明, BdorATPG阅读框全长354 bp, 编码117个氨基酸。氨基酸序列比对表明, BdorATPG的N端序列与其他物种的ATPG亚基对应区域具有较高的序列一致性。BdorATPG与拟暗果蝇Drosophila pseudoobscura ATPG亚基的氨基酸序列一致性最高, 为88.9%。三维结构模建结果表明, BdorATPG N端（第1~59位氨基酸）序列为α-螺旋结构, 亲水性和疏水性氨基酸在螺旋两侧呈对称分布。BdorATPG在不同组织中的荧光定量PCR分析表明, BdorATPG在各组织中都有表达, 其中在触角中的表达量最高; 在雄虫生殖节中的表达量是雌虫中的6.04倍。结果提示BdorATPG可能在雄虫生殖生理过程中发挥重要作用。     

黄河裸裂尻鱼细胞色素C氧化酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ亚基基因的克隆及序列特征分析

采用RT-PCR技术克隆获得了黄河裸裂尻鱼(Schizopygopsis pylzovi)CO Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ基因的编码序列,并对此进行了初步分析.结果表明,黄河裸裂尻鱼CO I基因全长为1 551 bp,开放阅读框(ORF)由基因全长组成,编码516个氨基酸;COⅡ基因全长为691 bp,开放阅读框为690 bp,编码2...     

钠离子通道β4亚基糖基化的初步研究

异常表达的糖蛋白与PD等多种神经退行性疾病有关。糖蛋白组学研究发现,电压门控钠离子通道β4亚基在PD病人脑组织中表达明显增加。为了深入探索β4亚基及其糖链在帕金森发生发展中的作用,采用PD转基因鼠对其表达进行验证,对其潜在的糖基化位点进行定点突变,构建重组表达质粒。结果发现,在新生PD转基因鼠和野生成鼠脑组织中有~38kDa蛋白条带表达,而在新生野生鼠脑组织中不表达;用PNGase F酶处理去除糖链后,~38kDa蛋白条带变成迁移速递更快的较小分子量条带,说明β4亚基是高度糖基化的蛋白,并且其糖基化与生长发育有关。将突变重组质粒转入HEK-293细胞和小鼠神经瘤细胞Neuro2A中表达,结果发现突变型质粒分子量明显低于野生型。为研究β4亚基及其糖链的功能提供了一定的实验数据并打下了基础。     

67份美国小麦种质资源的HMW-GS组成与品质分析

为了挖掘新的种质资源,对引自美国的67份小麦种质材料进行了高分子量麦谷蛋白亚基组成与品质性状分析。HMW-GS组成分析表明,在供试材料中共检测到20种亚基类型和25种亚基组合,表明这批材料的遗传多样性较高。在GluA1位点上,亚基1与2*的出现频率分别为16.4%与35.8%;Glu-B1位点有9个等位变异,其中出现频率最高的为7+9亚基对(47.8%);Glu-D1位点有8个等位变异,以5+10亚基对为主要类型,出现频率高达74.6%。在Glu-B1位点上发现3个不常见亚基7*、8*、8**和3个未知亚基a、b、c,还发现1个未知亚基,暂时将其标记为5*,可能位于Glu-D1位点上。亚基组合类型中,"null,7+8,5+10"的出现频率最高,为22.4%。亚基评分在5~10分之间,平均8.2分,得分在8分及其以上的材料有42份(62.69%),其中得10分的材料有9份(13.43%)。利用DA7200近红外成分分析仪对这批小麦材料的品质性状进行初步分析,结果表明其品质指标较低。这67份美国小麦材料含有的优质亚基比例较高,可作为中间材料以改良我国黄淮麦区小麦品种的亚基组成。     

ING4、PHDs以及HIF-1α在低氧性肺动脉高压大鼠中的表达变化

目的研究大鼠低氧性肺动脉高压(hypoxic pulmonary hypertension,HPH)模型中ING4表达变化的规律及其与PHDs、HIF-1α间的相互关系。方法实验复制HPH大鼠模型,在缺氧不同时间点,测定大鼠平均肺动脉压(mPAP)及右心室肥大指数(RVHI),HE染色观察肺小动脉重塑(HPVR)。原位杂交、RT-PCR、检测肺内ING4、PHD1、PHD2、PHD3及HIF-1α的mRNA表达水平及部位,免疫组化、Western blot检测以上蛋白质表达水平及部位。结果 (1)缺氧7d后大鼠的mPAP开始上升,与对照组比较有显著性差异(P0.05),缺氧14d后出现肺血管重塑和RVHI增加,与对照组比较有显著性差异(P0.05)。HIF-1α蛋白在缺氧3d组表达均开始升高(P0.05,与对照组比),缺氧7d达高峰,14d和21d稍下降。HIF-1αmRNA在缺氧14d后表达略增高(与对照组比较P0.05)。(2)对照组PHD1蛋白质呈阳性表达,缺氧14d下降,缺氧21d保持较低水平。PHD1mRNA表达差异无显著性。对照组PHD2蛋白质和mRNA呈阳性表达,缺氧3d增高,缺氧14d达高峰,缺氧21d保持较高水平。对照组PHD3蛋白质呈弱阳性表达,缺氧3d明显增高,缺氧7d保持高水平,缺氧14d和21d下降。对照组肺小血管PHD3mRNA缺氧3d后迅速增高,缺氧14d达高峰,缺氧21d保持高水平。(3)对照组ING4蛋白质呈弱阳性表达,缺氧3d和7d后表达增高,缺氧14d达高峰,缺氧21d稍有下降。对照组ING4mRNA呈阳性表达,缺氧7d组比表达显著增高,直线相关分析表明,在缺氧组大鼠中ING4蛋白质与HIF-1α蛋白质及mPAP、RVHI、WA%负相关。结论肺动脉高压大鼠模型中ING4、PHDs和HIF-1α的表达变化,可能在HPH的发生和发展中发挥作用。     

小麦高分子量麦谷蛋白亚基分离方法的研究

小麦高分子量麦谷蛋白亚基（ＨＭＷ－ＧＳ）与小麦面包烘烤质量和面粉的加工特性密切相关,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ是其常用的分离方法之一。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ方法一般分为２类：第一类采用１１％和５％浓度的胶,后者用于分离２亚基和２＾＊亚基,该种方法常使用碱性提取液,需要２次电泳过程,且在５％浓度的胶中ＨＭＷ－ＧＳ易于和麦醇蛋白混淆;另外一类ＳＤＳ－ＰＡＧＥ采用梯度胶,配合使用银染方法,制梯度胶则使用梯度仪及磁力搅拌     

大豆液泡膜H~+-ATPase的纯化和重组

通过不连续蔗糖密度梯度离心得到的液泡膜微囊 ,先由胆酸钠和 OG分步破膜抽提、经阴离子交换柱 ( Q- Sepharose)层析分离 .纯化后的酶含 V型 H+ - ATPase的主要亚基 ,与大豆磷脂重组 ,获得了有较高泵活性的脂酶体 .脂酶体的质子泵活性受 Valinomycin激活 ,说明它是致电性的 ,受NO-3 ,DCCD以及特异性的 V型 ATPase抑制剂 Bafilomycin的抑制 .脂酶体的泵活性不受 F型和P型 ATPase抑制剂抑制 ,表明质子转运是由 V型 H+ - ATPase引起的 .     

鸡发育过程肌组织核提抽物结合活性与AChRγ亚基基因持续表达的关系

烟碱样乙酰胆碱受体 ( n ACh R)是由 4种亚基组成的五聚体 .哺乳类动物出生后γ亚基由ε亚基取代 ,迄今为止鸡 n ACh Rγ基因是否存在上述置换规律尚无定论 .为探索发育过程鸡骨骼肌n ACh R基因表达是否存在γ/ε亚基的置换及其机制 ,采用 RT- PCR技术和凝胶阻滞试验检测了鸡胚发育 9d至出生后 6周小鸡 γ基因表达的动力学及骨骼肌核抽提物的 DNA结合活性 .RT-PCR检测结果显示 ,在鸡胚发育 9d至出生后 6周的雏鸡骨骼肌组织均检出有 γ亚基 m RNA转录 .提示与哺乳类不同 ,出生前后鸡骨骼肌组织 ACh Rγ亚基基因持续表达 ,不存在 γ/ε亚基的置换表达规律 .以 γ基因 - 2 60 /- 2 4 0 (含 E盒与 M- CAT盒重叠序列 )和 - 2 39/- 50 (含 M- CAT盒及 GC富含区 )片段为探针 ,分别与鸡胚发育 9d至出生后 2周小鸡骨骼肌的核抽提物进行凝胶阻滞试验 .在发育各阶段的骨骼肌核抽提物中均有识别 - 2 39/- 50片段的结合活性存在 ,但在出生后 2周小鸡骨骼肌的核抽提物中未检出 - 2 60 /- 2 4 0结合活性 .结果提示 ,在出生后第 1 4d的肌核抽提物中存在的、识别并结合 - 2 39/- 50片段的活性物质与鸡 ACh Rγ基因在出生后持续表达有关 .     

霍乱毒素A基因内部翻译调控元件具有翻译起始功能

通过大肠杆菌体外转录－体外翻译系统,证明霍乱毒素Ａ基因内部的翻译调控元件具有翻译起始功能,且其翻译起始效率较ｃｔｘＡ基因高得多,当ｃｔｘＡ的起始密码突变时,从该元件起始的翻译效率下降,说明基因内翻译起以ｃｔｘＡ翻译起始的调控。结果进一步证实了霍乱毒素Ａ、Ｂ亚工比例表达调控的翻译弱化－翻译偶联机理。