O-超家族芋螺毒素研究进展

O-超家族芋螺毒素是芋螺毒素中较复杂的超家族之一,它包括δ、μO-、ω-、κ-等若干成员,通常由24-33个氨基酸组成,具有相同的三对二硫键骨架,形成ICK模体,能特异性作用于电压门控离子通道。本文主要对该芋螺毒素生物化学及分子遗传学特征、生理学和药理学特征、结构与性能的关系及应用研究与前景等进行综述。     

多二硫键蛋白在大肠杆菌中的表达研究

真核生物的许多蛋白富含二硫键。由于大肠杆菌细胞质中含有二硫键还原酶,利用大肠杆菌生产具有生物活性的重组二硫键蛋白充满挑战。近年来,SHuffle菌株、超氧化性细胞的相继问世,利用分子伴侣或引入二硫键从头形成体系,使多二硫键蛋白在大肠杆菌中的表达成为可能。简要概述了野生型大肠杆菌细胞周质和经遗传改造的工程菌细胞质中二硫键的形成机制,并着重介绍了近年来重组二硫键蛋白表达策略的最新研究进展,对利用大肠杆菌反应器生产富含二硫键蛋白起指导意义。     

重组单链胰岛素在含有巯基试剂的变性剂中的解折叠

重组单链胰岛素(PIP)含有3对二硫键。在含有巯基试剂的变性剂中,PIP产生二硫键交换从而形成一系列具有不同解折叠程度的二硫键异构体混合物。分别用高压液相色谱（HPLC）和圆二色性（CD）光谱分析了PIP在含有0．2mmol/L2－巯基乙醇的尿素和盐酸胍中的解中的解折叠程度。PIP二硫键异构体混合物通过胰蛋白酶酶解并用质谱测定酶解片段的分子量,证明PIP确实产生了二硫键交换。同时还分离纯化了PIP的一种主要非天然二硫键异构体并研究了它重新折叠成天然构象的情况。观察到PIP只有一种热力学稳定的二硫键配对方式,PIP的非天然二硫键异构体在巯基试剂存在的条件下可以高效转化为天然二硫键配对。还将PIP解折叠和再折叠的情况与胰岛素样生长因子－I（IGF－I）及胰岛素做了比较：胰岛素和PIP只折叠成一种热力学稳定的三级结构,IGF－I却折叠成两种热力学稳定的二硫键异构体;胰岛素的双链重组需缓慢进行,而PIP却可以快速折叠。     

中药合剂CB在晶状体白内障形成中对巯基及二硫键的作用

用白内障诱发剂三硝基甲苯、平阳霉素、亚硒酸钠和半乳糖分别加入大鼠晶状体培养基中,共同培养２４ｈ,同时在各培养基中分别加入中药合剂ＣＢ,以观察其药效,用维生素Ｃ作对照。结果表明中药合剂ＣＢ能够保护非蛋白质巯基免致氧化,抑制蛋白质巯基交联,降低晶状体不溶性蛋白质中二硫键含量,故中药合剂ＣＢ有可能作为抗白内障药物应用于临床。     

理性设计二硫键提高华根霉脂肪酶热稳定性

【背景】华根霉脂肪酶的工业应用前景广泛,但是受到酶热稳定性较差的限制。【目的】对华根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021脂肪酶r27RCL分子结构进行理性设计,以提高该酶热稳定性。【方法】以Disulfide by design软件筛选r27RCL分子表面能够形成二硫键的突变位点,共得到7对二硫键突变。利用全质粒PCR进行定点突变,并在毕赤酵母中表达获得突变酶。【结果】最佳突变酶m9/10 (S85C-Q145C)与野生型酶r27RCL相比,60°C下的半衰期分别提高了4.5倍,T_m值提高了4.2°C,而催化活性保持不变。蛋白质晶体结构模拟显示,位于β2折叠上的85C和位于α4螺旋上的145C可形成二硫键,从而提高酶的热稳定性。【结论】酶分子中引入新增二硫键可以显著提升酶的热稳定性。     

重组hepcidin的分离纯化及鉴定

建立了重组hepcidin的分离纯化方法,并鉴定其抗菌活性。经金属螯合初步纯化的重组蛋白在cysteine/cystine氧化还原体系中氧化形成二硫键,用变性条件下的凝胶过滤除去多聚体,稀释复性后用于肠激酶酶切反应,得到重组hepcidin。融合蛋白His-hepcidin经氧化、复性后的总收率为50%,纯度大于95%。酶切后所得重组hepcidin经抑菌圈试验检验,对枯草芽孢杆菌具有抗菌活性。LC-ESI-MS与园二色光谱检测显示重组hepcidin与天然hepcidin相对分子质量相同、二级结构相似。     

人蛋白二硫键异构酶的纯化及其抗血清制备

人蛋白二硫键异构酶的纯化及其抗血清制备吴秉毅,冯桂湘,吕静,张帆,冯永清,王福琴（第一军医大学珠江医院广州５１０２８０）关键词蛋白二硫键异构酶,分离与纯化,抗血清制备二硫键在维持蛋白质的空间结构、生物学活性中起重要作用。二硫键的形成是蛋白质翻译后修饰...     

蛋白质二硫键异构酶—一种可能参与蛋白质生物合成的酶

蛋白质二硫键异构酶分布很广,种属间比较保守,定位于内质网膜上,组织分布、活力水平与含二硫键的蛋白质的合成平行,而且底物专一性很差,催化巯基二硫键交换,提示它可能参与蛋白质的生物合成。     

凝乳酶原（凝乳酶）二硫键Ｃys206—Cys210的定位突变

在对凝乳酶原二硫键Ｃys206-Cys210进行定位突变过程中发现,在相应的模板序列中有自身形成自由能为－１６．１kcal/mol的茎环结构倾向,妨碍与引物结合,从而难以合成突变的ＤＮＡ,采用快退火可解决此矛盾。５个突变基因均能在大肠杆菌中高效表达,除Ｃ２０６Ａ外,约占细胞总蛋白的５０％左右,突变的复性结果表明,Ｃys206-Cys210对凝乳酶原正确折叠不是绝对必需的,但相应位置的氨基酸取代对复性效率有显著影响,在５个突变体中,Ｃ２０６Ａ／Ｃ２１０Ａ的复性率分别为Ｃ２０６Ｓ／Ｃ２１０Ｓ、Ｃ２１０Ａ、Ｃ２１０Ｓ的４．５倍、２０倍和３０倍,而C206A不能复性。Ｃ２０６Ａ／Ｃ２１０Ａ与Ｃ２０６Ｓ／Ｃ２１０Ｓ的远紫外ＣＤ光谱与野生型基本相同,其荧光发射光谱与野生型相比最大发射峰不变,而荧光强度有显著增加由于上述３个蛋白具有相同比活,说明突变分子能形成具有生物活性的空间构象,而只是某些色氨酸残基微环境受到微扰。     

脓青素促进叶绿体中细胞色素b－559的光还原

当脓青素存在时，可以观察到菠菜叶绿体中光诱导的５５９ｎｍ吸收增加。此反应可以被光（波长６５０ｎｍ）诱导，但远红光（波长７２０ｎｍ）则无作用．光暗差示光谱表明被还原的物质为细胞色素ｂ－５５９。脓青素的作用在１μｍｏｌ／Ｌ接近饱和．并且其作用与跨膜质子梯度无关．脓青素所促进的细胞色素ｂ－５５９光还原被抑制剂ＤＣＭＵ和ＤＢＭＩＢ所抑制，但在氰化钾处理过的叶绿体中，脓青素依然促进细胞色素ｂ－５５９的光还原．在ＣＣＣＰ处理的叶绿体中，可以看到低光强红光诱导的细胞色素ｂ－５５９氧化。脓青素可以逆转ＣＣＣＰ的作用；促进细胞色素ｂ－５５９在高光强或低光强下都为红光还原。我们推测脓青素通过质子化作用，影响了细胞色素ｂ－５５９的光氧化还原反应．