原核表达hbFGF结构与功能优化的研究

野生型hbFGF蛋白可溶性与稳定性较低一直是困扰研发人员的难题。分析其氨基酸序列发现含有 4个游离巯基 ,其中第 78、96、1 0 1位半胱氨酸游离巯基可能直接影响其可溶性、稳定性及活性。对天然hbFGF进行定点突变 ,一组将Cys78、Cys96同时突变 ,另一组将Cys78、Cys96与Cys1 0 1进行联合突变 ,均改为丝氨酸密码子 ,然后克隆入原核表达载体pET 3c ,进行表达 ,结果发现两种突变蛋白的可溶性大幅度增加 ,稳定性明显上升 ,其中三点突变的效果更为显著 ,但蛋白质的活性明显下降。可以认为 78、96与 1 0 1位半胱氨酸的游离巯基同时参与了天然hbFGF多聚体的形成 ,是导致野生型hbFGF可溶性与稳定性较低的主要原因 ,Cys1 0 1还与维持hbFGF的活性直接有关     

共转化大肠杆菌hemA和hemL基因增强小麦过氧化物酶WP1在原核系统中的功能性表达

小麦种子过氧化物酶WP1属于含血红素的植物Ⅲ型过氧化物酶,该酶不仅具有抗真菌活性,而且影响面粉加工品质。为提高WP1在大肠杆菌中的功能性表达,构建了用于提高大肠杆菌内源血红素合成,包含hemA和hemL基因的重组质粒pACYC-A-L,将其分别与包含WP1基因的分泌型和非分泌型表达载体pMAL-p4x-WP1与pET21a-MBP-WP1共同转化大肠杆菌T7 Express菌株;利用直链淀粉(Amylose)亲和层析柱纯化获得MBP-WP1融合蛋白,并以2,2’-联氮-二(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)为底物检测重组WP1的催化能力。结果表明,含pACYC-A-L的宿主菌28℃诱导12 h后,培养液中5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)含量可达146.73 mg/L,卟啉类物质含量也显著上升。共转化pACYC-A-L和pMAL-p4x-WP1比单独转化pET21a-MBP-WP1获得的重组WP1的比活力提高14.6倍。该研究不仅成功地增强了小麦WP1在大肠杆菌中的功能性表达,同时为其他具有重要生物学功能并含血红素辅基蛋白的功能性表达提供了有益参考。     

二硫键异构酶

天然二硫键的形成是许多蛋白正确折叠中的限速步骤,在稳定蛋白质构象和保持蛋白质活性方面起重要作用。讨论的二硫键异构酶是内质网中一种重要的蛋白折叠催化剂,它催化蛋白二硫键的形成和错误配对二硫键的重排,并有抑制错误折叠蛋白聚集的分子伴侣活性。PDI广泛应用于基因工程上提高外源蛋白表达水平。     

一种新4/3型α-芋螺毒素突变体的合成及功能研究

目的：合成难溶的新4/3型α-芋螺毒素Eb1.3突变体Eb1.3［ΔR1,W13M］,并初步测定其与烟碱型乙酰胆碱受体亚型的结合作用。方法：采用Fmoc-固相法合成线性肽Eb1.3［ΔR1,W13M］,通过空气氧化折叠和磺化产物折叠获得含二硫键的折叠产物,利用两步折叠法测定其二硫键连接方式,双电极电压钳技术检测其药理活性。结果：Eb1.3［ΔR1,W13M］线性肽经折叠生成的主产物Ⅰ的二硫键排列方式为少见的C1-C4、C2-C3,而非典型的C1-C3、C2-C4,线性肽磺化后再经GSH交换可加速折叠,10 μmol/L的产物Ⅰ对乙酰胆碱受体α3β2亚型的抑制率为28.97%±8.44%。结论：新4/3型α-芋螺毒素Eb1.3突变体Eb1.3［ΔR1,W13M］形成非典型的二硫键C1-C4、C2-C3,产物Ⅰ对乙酰胆碱受体α3β2亚型具有一定的结合活性。     

核苷二磷酸激酶A的定点突变及C4S突变体的制备和活性研究

目的:对核苷二磷酸激酶A(NDPK-A)二硫键异构的关键残基C4进行定点突变,构建、表达并纯化C4S突变体,测定其磷酸转移酶活性和DNase活性,研究二硫键异构对NDPK-A活性的影响。方法:以pBV220-nm23-H1质粒作为模板,通过设计合适的引物对NDPK-A进行定点突变,将第4位半胱氨酸突变为丝氨酸,构建NDPK-AC4S突变体;在大肠杆菌BL21中表达,DEAE-sepharose Fas tFlow与Cibacron Blue 3GA Sepharose CL-4B纯化目的蛋白,获得均一重组蛋白,纯度达到98%;DNA序列测定及重组蛋白的肽质量指纹图谱(PMF)分析均证明构建正确突变体;高效液相色谱法(HPLC)与DNA消化法分别测定野生型NDPK-A与C4S突变体的磷酸转移酶活性与DNase活性差异。结果:NDPK-AC4S突变体的磷酸基转移酶与DNase酶活性均高于野生型NDPK-A。结论:NDPK-A缺失二硫键后,活性增高。NDPK-A形成链内二硫键可能是其活性负调控模式之一。     

蛋白质复性研究进展

许多蛋白在大肠杆菌中高效表达时,其产物常以无活性的包含体形式存在,包含体蛋白的复性往往是制备这些蛋白的关键步骤之一,蛋白复性包括肽链折叠和分子内二硫键的氧化这两个互相影响的过程,本文综述了蛋白折叠过程的研究进展,及促进蛋白折叠和二硫键氧化的方法。     

A-超家族芋螺毒素研究进展

芋螺毒素是生物毒素中迅速发展的新领域,是很有价值的药物或药物先导化合物,其中A-超家族芋螺毒素是研究最早、了解较为全面的芋螺毒素家族之一,由于其高丰度、化学多样性、强专一性作用等突出特点成为创新药物发展的宝库。A-超家族芋螺毒素因能选择性阻断nAChRs的某种亚型,使它们可作为鉴定nAChRs及其亚基的有效工具。此外,在药理学方面,A-超家族芋螺毒素除了作为镇痛药物已进入临床研究外,也有望开发成用于治疗焦虑症、帕金森氏病、肌肉紧张和高血压等病症的药物。     

表皮葡萄球菌SarA对atlE、lipA和zinC基因表达调控的研究

表皮葡萄球菌 (Staphylococcus epidermids) 是一种条件致病菌，SarA(Staphylococcal accessory regulator A)是该菌中一个全局性调控因子，它控制着细胞中许多与毒性相关的基因表达. 报道了SarA在转录水平直接调控atlE、lipA和zinC基因的表达. RT-PCR和lacZ报告基因的分析结果显示，在表皮葡萄球菌ATCC35984中，SarA对atlE (自溶酶基因) 表达起负调控作用，而对lipA (脂肪酶基因) 和zinC (膜相关锌金属蛋白酶基因) 的表达则有正调控作用. 生物信息学分析表明，SarA控制atlE，lipA和zinC 3种基因表达可能是通过与被调控基因上游的特定DNA序列的结合来实现的，该DNA结合区保守并富含AT碱基. 根据已报道的金黄色葡萄球菌中SarA的结合位点序列，利用Omiga软件分析并推测了SarA结合atlE，lipA和zinC的可能区域. 基于SarA是一种多功能的毒素相关调控因子，结果提示，SarA能调控众多因子，可以作为防治表皮葡萄球菌感染的一个药物筛选靶点.     

芋螺毒素氧化折叠研究进展

芋螺毒素(conotoxin,CTX)是当今生物毒素研究的热点之一,已经成为研究药理学和神经科学的重要工具。因此,芋螺毒素如何在体内和体外进行氧化折叠形成天然构象,获得有生物活性的芋螺毒素,越来越为人们所关注。根据当前研究状况,概述了芋螺毒素氧化折叠的一般过程,并总结了二硫键、PDI(二硫键异构酶)、前体肽等在芋螺毒素氧化折叠中所发挥的作用。此外,还就芋螺毒素氧化重折叠的研究前景和方向进行了展望。