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CN101875962A一种生物电化学技术筛选高效产甲烷菌群的方法本发明涉及一种生物电化学技术筛选高效产甲烷菌的方法。该方法由厌氧部分和电化学部分两部分组成,通过生物电化学作用从剩余活性污泥、厌氧污泥或河道底泥中筛选高效产甲烷菌(群)。该操作方法将接种物置于厌氧发酵罐中,在发酵罐中加入阴阳两电极,并向两极上输入0.1~2.0 V的直流电,向发酵罐     

乳杆菌Lactobacillus sp.lxp发酵高产L-乳酸研究

筛选得到一株乳杆菌Laetobaeillus sp．,进行发酵生产高浓度L-乳酸的研究。考察了种龄、接种量、温度和不同pH调节剂对乳酸发酵的影响。结果表明：最佳种子培养时间为15h;最佳接种量为15％;最适培养温度为42℃;与氨水和氢氧化钠相比,碳酸钙更适于作为发酵过程的pH调节刺;以葡萄糖为碳源,添加豆粕水解液和玉米浆作为辅料,2L罐培养120h,L-乳酸质量浓度可达202 g/L,糖转化率91．3％,L-乳酸占发酵液中总酸含量98％以上。     

L-乳酸细菌培养条件的优化

实验通过对L-乳酸细菌(Lactobacillus casei FH-2)菌体生长、产酸速率、耐酸水平、高糖发酵性能的优化,实现了优化该菌生长和条件的目的。并对培养基中不同辅料的添加进行了研究。结果证明：共同加入麦根一麸皮浸泡液时,可以提高乳酸的产量,其最佳方案为50℃、4h、1％麸皮浸泡液和2％麦根。乳酸产量为40．5g/L。结论：实验通过优化L-乳酸细菌的发酵条件提高了乳酸的产量。     

偶联羟化反应和辅酶再生体系产9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮

9α-羟基雄甾-4-烯-3,17-二酮(9-OH-AD)是一种重要的甾体药物中间体,可以用来制备β-甾酮,地塞米松和其他类固醇化合物。3-甾酮9α-羟基化酶(KSH)是由两个亚基即末端氧化亚基(KshA)和铁氧还蛋白还原亚基(KshB)构成的。在本研究中,人工合成了来源于分枝杆菌Mycobacterium sp.Strain VKM Ac-1817D的kshA和kshB基因,通过优化表达载体促进了KshA和KshB在E.coli BL21(DE3)中的可溶性表达,并探究了催化体系中KSH还原亚基和氧化亚基的最适添加比例。此外,KSH转化雄甾-4-烯-3,17-二酮(AD)为9-OH-AD的过程中需要辅酶NADH。本研究构建了羟基化反应与利用葡萄糖脱氢酶(GDH)的NADH辅酶再生反应的偶联体系。为了进一步提高转化效率,本研究进行了转化条件的优化,并采取了分批补料的策略,最终9-OH-AD产量为4.78 g/L,转化率为96.7%。此种酶介导的转化生产9-OH-AD的方法为甾体药物生产提供了一种环境友好和经济实用型的新策略。     

茄科作物青枯菌NADH脱氢酶F亚基在细胞运动和致病性中的功能研究

[目的]劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）在茄科作物上引起严重的细菌性青枯病,本研究旨在发掘青枯劳尔氏菌与致病相关的基因。[方法]利用Tn5转座子构建随机插入突变体,分析生物膜形成、细胞运动和致病性;对有表型变化的突变体,运用TAIL-PCR方法鉴定Tn5插入位点,确定所突变的基因。[结果]以模式菌株GMI000为出发菌,总共获得了400个突变体,其中2个突变体不能形成生物膜,在软琼脂平板上的运动能力下降;接种感病番茄植物,这2个突变体都不能引起萎焉症状。TAIL-PCR结果显示,2个突变体的Tn5插入位点都在NADH脱氢酶F亚基（nuoF）中,距离翻译起始位点分别为103-bp和225-bp。ripAY基因启动子推动的nuoF基因互补载体,完全恢复了2个突变体的表型。[结论]NADH脱氢酶复合物是微生物呼吸电子传递链中的第一步催化酶。我们的结果表明,NADH脱氢酶复合物对R.solanacearum生物膜形成、细胞运动和致病性也有重要作用。     

人二氢乳清酸脱氢酶蛋白的表达、纯化及其与新型抑制剂的晶体结构

人二氢乳清酸脱氢酶（human dihydroorotate dehydrogenase, hDHODH）是催化嘧啶从头合成途径的一个关键酶。近年来,多种研究表明,抑制该酶可缓解类风湿性关节炎的症状。但该酶的抑制剂甚少,寻找该酶的高效抑制剂具有重要意义。本研究利用PCR技术扩增hDHODH基因,构建重组质粒pET-19b-hDHODH,并在大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli ) BL21(DE3)中表达,获得可溶性蛋白质。用Ni2+-NTA亲和层析柱对蛋白质进行纯化,获得较高（90%）纯度的hDHODH蛋白,将蛋白质与抑制剂3-(5-乙硫基)-1H-1, 2, 4-三氮唑-3-)苯甲酸和底物DHO混合孵育。用Hampton试剂盒初筛晶体并用棋盘法进行优化,获得晶形完美、衍射能力很强的hDHODH蛋白复合物单晶。用X射线衍射晶体,用CCP4、Coot软件解析结构,获得hDHODH蛋白复合物晶体结构。从解析的结构中可以看出,抑制剂与蛋白质的吻合度非常高,且抑制剂通过亲水的羧基端与蛋白质356位和147位的酪氨酸形成氢键网络。抑制剂的5元环与蛋白质359位的亮氨酸和360位的苏氨酸相互作用,使抑制剂与蛋白质牢固结合。该复合物晶体结构的顺利解析,将为开发新型特异性抗类风湿性关节炎药物提供重要基础。     

S-亚胺还原酶和葡萄糖脱氢酶共表达系统的构建及手性胺的合成

旨在构建S-亚胺还原酶(S-IRED)和葡萄糖脱氢酶(GDH)在大肠杆菌中的一菌双酶共表达系统,实现辅酶NADPH的再生,高效合成手性仲胺。利用无缝克隆的手段设计构建一种单质粒双启动子共表达系统,以全细胞为催化剂催化手性仲胺S-2-甲基吡咯烷(S-2MP)的合成,并研究温度、pH及有机溶剂对双酶反应的影响。成功构建了S-IRED和GDH的重组共表达质粒,实现了S-IRED与GDH在大肠杆菌中的胞内共表达,以亚胺2-甲基吡咯啉(2MPN)为模式底物,以工程菌全细胞催化手性仲胺S-2MP的合成,在低辅酶添加时催化手性胺的产率和光学纯度均高于95%。该双酶共表达体系的最适温度和pH分别为37℃和pH 8,10%以下的甲醇对双酶反应有正向促进作用。大肠杆菌胞内双酶共表达系统的构建实现了辅酶NADPH的原位再生,降低了亚胺还原酶催化合成手性胺的成本,为手性胺的规模制备奠定了基础。     

我国男子橄榄球运动员有氧能力的评定和比赛时能耗的初探*

目的:探究我国男子橄榄球运动员的有氧能力和比赛时的能量消耗,为精准化训练和比赛时营养策略的制定提供理论依据。方法:以18名男子橄榄球运动员(健将级)为研究对象,分别进行最大摄氧量(VO₂max),乳酸阈(LT)和conconi场地测试来评定其有氧能力,并比较前、后锋之间的供能差异,用wGT3X加速度计结合团队心率探究比赛时的能量消耗,所得数据进行独立样本t检验。结果:本次检测的橄榄球运动员相对最大摄氧量较差为(42.05±3.69) ml/min·kg^-1,前峰队员相对最大摄氧量为(38.83±3.52) ml/min·kg^-1、后锋队员相对最大摄氧量为(47.31±3.17)ml/min·kg^-1,二者之间的差异有统计学意义(P＜0.05);血乳酸阈测定在7 min时出现血乳酸拐点,后锋的血乳酸阈值要高于前锋运动员;conconi场地测试与实验室VO₂max有较高的相关性(r=0.772)。比赛中平均能量消耗上半场约为(276.94±18.08) kcals,下半场约为(225.58±22.86) kcals,下半场的能耗小于上半场(P＜0.05)。结论:英式7人制橄榄球运动员有氧能力较弱,且前、后锋队员存在差异。     

胆碱脱氢酶的动力学性质

本文对增溶胆碱脱氢酶的稳态初速度及产物抑制动力学做了。底物胆碱和ＰＭＳ的相互影响：变化一个底物的浓度,另一个底物的Ｋｍ及Ｖｍａｘ均变化。该酶的产物三甲胺 地 制表现为对底物胆碱非竞争性而地ＰＭＳ竞争性,在胆碱饱和的情况下,三甲胺乙醛对酶的抑制仍表现为对ＰＭＳ竞争性。这些结果表明增溶胆碱脱氢酶的催化机制搂双底物双产物乒乓机制。１－ＰＣ与９－ＡＣ对增溶胆碱脱氢酶均有抑制作用,且均为混和型抑制,Ｋ１分别     

蜡样芽胞杆菌磷脂酶C在乳酸克鲁维酵母中重组表达、纯化及酶学性质分析

【目的】构建蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)磷脂酶C(Phospholipase C,PLC)的重组乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)菌株、纯化重组蛋白并对其进行酶学性质分析。【方法】以B.cereus基因组DNA为模板,PCR扩增得到磷脂酶C基因(bcplc),构建重组乳酸克鲁维酵母表达质粒并转化到乳酸克鲁维酵母中,实现bcplc基因的表达。利用镍柱亲和层析纯化和脱盐柱得到电泳纯的重组磷脂酶C(rbcPLC)。【结果】成功构建产磷脂酶C的重组乳酸克鲁维酵母并纯化了重组磷脂酶C,纯化后rbcPLC经SDS-PAGE分析在40 kDa附近出现显性条带。NPPC法测得rbcPLC酶活为19251 U/mg,最适反应温度为80°C,最适pH为9.0。在低于40°C时,pH 7.0-8.0时,rbcPLC重组酶较稳定。Cu~(2+)和Co~(2+)对其有明显的抑制作用;Zn~(2+)、Mn~(2+)、Ca~(2+)、Mg~(2+)对其有明显的促进作用。【结论】首次实现了对蜡样芽胞杆菌来源的磷脂酶C在乳酸克鲁维酵母中的重组表达、纯化及其酶学性质分析,为其它食品安全性微生物来源的磷脂酶C的研究提供了借鉴意义。