酿酒酵母乙醇耐性的分子机制及基因工程改造

提高工业微生物对毒性代谢产物及高温等环境胁迫因素的耐受性对工业生产具有重要的意义。发酵过程中产生的乙醇对酵母细胞的生长和代谢都具有较强的抑制作用,是酿酒酵母的重要环境胁迫因素之一。对酿酒酵母乙醇耐性的分子机制的研究可为选育具有较强乙醇耐受性的酵母菌种提供理论基础。近年来,通过细胞全局基因转录分析和基因功能分析,对酿酒酵母乙醇耐性的分子机制有了更多新的认识,揭示了很多新的与乙醇耐性相关的基因,并在此基础上,通过对相关基因进行过量表达或敲除,成功提高了酵母菌的乙醇耐性。以下综述了近年来酵母菌乙醇耐性的生物化学与分子生物学机制的研究进展,以及构建具有较高乙醇耐性的酵母菌的基因工程操作。这些研究不仅加深了对酿酒酵母乙醇耐性的机理认识,也可为高效进行生物转化生产生物质能源奠定理论基础。     

偶发分枝杆菌MF2和MF96生物转化差异的机理研究

偶发分枝杆菌（Mycobacterium fortuitum）亲株（MF2）和突变株（MF96）存在生物转化差异,通过静息细胞系统转化研究发现：在反应达到平衡后,亲株中产物大部分以雄甾烯二酮（△4_androstenedione,4AD）的形式存在,而突变株中产物大部分为睾酮（testosterone,TS）。为了研究二者的转化差异,采用无细胞系统转化的手段进行了比较研究,结果表明：在添加足量的NAD+和NADH后,亲株和突变株的转化产物比例基本相同。由此推测：在静息细胞中的转化产物比例不同可能是由于辅酶NAD+与NADH的比例不同引起的。最后通过测定亲株和突变株中辅酶NAD+和NADH的比例证实该推测是正确的。     

表达3-甾酮-△1-脱氢酶降解植物甾醇合成雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮

构建分枝杆菌表达载体pMTac并在分枝杆菌Mycobacterium neoaurum JC-12中加强表达甾醇降解过程中的关键酶3-甾酮-△1-脱氢酶(KSDD)以提高雄甾-1,4-二烯-3,17-二铜(ADD)的产量。将p MF41的启动子pACE替换成tac启动子构建载体pMTac,在分枝杆菌中分别表达报告基因绿色荧光蛋白(GFP)和关键酶KSDD,通过GFP亮度和KSDD酶活验证tac启动子在M.neoaurum JC-12中的效果,并发酵验证加强表达KSDD对产物ADD的影响。荧光显微照片表明两个载体均能在M.neoaurum JC-12表达GFP,但tac启动子的效果比pACE强。酶活测定结果为重组菌M.neoaurum JC-12/pMTac-ksdd破碎细胞上清液中KSDD酶活比原始菌提高了6.53倍,比M.neoaurum JC-12/pMF41-ksdd提高了4.36倍。摇瓶发酵显示重组菌M.neoaurum JC-12/pMTac-ksdd ADD的产量比原始菌提高了22.2%,由4.86 g/L提高到5.94 g/L,而AD的产量由0.92 g/L减少到0.17 g/L,降低了81.5%;与M.neoaurum JC-12/p MF41-ksdd比,ADD产量提高了12.7%,AD降低了71.2%。以20 g/L植物甾醇为底物,5 L发酵罐中重组菌M.neoaurum JC-12/pMTac-ksdd的ADD产量达到10.28 g/L。结果表明,构建的新型表达载体pMTac适用于在M.neoaurum JC-12中加强表达关键酶KSDD,而且在M.neoaurum JC-12中过量表达KSDD有助于ADD产量的提高,为目前报道的发酵法利用新金色分枝杆菌降解植物甾醇合成ADD的最高水平。     

蜂毒肽的溶血作用与红细胞膜上两种酶活性变化的关系

从蜂毒肽作用于红细胞膜上的Na^＋-K^＋-ATPase和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G-6-PD)活性变化的角度,利用分光光度法测定酶活性,研究蜂毒肽与红细胞及膜作用过程中可能的靶点,讨论了蜂毒肽溶血过程与RBC膜上2种酶活性的变化．结果发现,蜂毒肽抑制RBC膜上酶活性的主要模式为附着/插入质膜与游离态并存模式,附着/插入质膜中的作用大于游离态的作用．Na^＋-K^＋-ATPase的K⁺结合位点是蜂毒肽的1个作用靶点．蜂毒肽插膜过程与其对此酶的作用随时间延长同步发生．蜂毒肽通过作用于葡萄糖-6-磷酸和NADP使G-6-PD的催化受到缓慢抑制,蜂毒肽形成四聚体的程度与酶活性密切相关．EDTA抑制蜂毒肽聚集,干扰蜂毒肽作用于G-6-P,蜂毒肽作用于底物G-6-P及辅酶NADP的生化机理相似,蜂毒肽抑制作用与G-6-PD的结构无关.     

泰山郝鳞鱼同工酶的研究

采用琼脂糖凝胶电泳或聚丙酰胺垂直板凝胶电泳（ＰＡＧＥ）技术研究了泰赤鳞鱼早期发育阶段（受精后０－１２０ｈ）及成体眼、脑、心、肾、肝、肌６种组织中的ＬＤＨ同工酶分化表达谱式。结果表明：（１）赤鳞鱼在胚胎发育过程中Ｌｄｈ－Ａ基因和－Ｂ基因同时表达,形成５种不同形式的四聚体（Ｂ４、ＡＢ３、Ｂ３Ｂ、Ａ４）。与大多数硬骨鱼相比,赤鳞鱼ＬＤＨ同工酶具有独特的早期个体发育谱式：在整个胚胎发育时期,Ａ亚基与Ｂ亚基     

废糟液全循环对自絮凝酵母糖酵解途径关键酶、胁迫相关代谢物及胞内组分的影响

旨在研究废糟液直接全循环对絮凝酵母乙醇发酵、糖酵解关键酶以及细胞组成的影响。在一有效容积1.5 L的搅拌式生物反应器中,使用葡萄糖为220 g/L,添加8 g/L酵母粉和6 g/L蛋白胨的培养基,以0.04 h?1的稀释率进行自絮凝颗粒酵母乙醇连续发酵。每隔3天将收集到的发酵液集中精馏处理,得到的废糟液用于配制发酵培养基。装置运行近20 d,实验结果表明,随着废液循环批次的增加,系统乙醇和生物量浓度明显降低,糖酵解途径3个关键限速酶:己糖激酶、6-磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶不同程度受到抑制。为了应对废糟液中高沸点副产物积累导致的环境胁迫,维持细胞正常代谢,甘油和菌体胞内蛋白生物合成加强,碳水化合物积累减弱。这些研究结果对进一步研究高沸点副产物积累对酵母细胞乙醇发酵影响的机理和菌种的代谢工程改造,具有重要意义。     

酿酒酵母细胞表面展示技术在燃料乙醇生产中的应用及研究进展

酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae细胞表面展示表达系统是一种固定化表达异源蛋白质的真核展示系统,具有糖基化作用及蛋白翻译后折叠等优势,更利于基因工程操作。近年来,酵母细胞表面工程作为一种新兴策略来固定化淀粉水解酶、纤维素水解酶以及木聚糖降解酶,从而应用于燃料乙醇的生产。文中着重介绍了酵母细胞表面展示系统的基本原理、研究现状以及在生物乙醇生产中的应用前景及所面临的挑战。     

高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中的胞内表达

γ-亚麻酸（GLA）作为人体必需的不饱和脂肪酸,具有重要的营养和药用价值。Δ⁶-脂肪酸脱氢酶是γ-亚麻酸合成途径中的关键酶。为了在毕赤酵母中建立一种新的合成γ-亚麻酸的表达体系,将高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因与胞内表达载体pPIC3.5K连接,SacⅠ线性化后电击法转化毕赤酵母SMD1168,获得的转化子经PCR鉴定目的基因已整合到毕赤酵母的基因组中。用甲醇诱导表达,通过脂肪酸气相色谱和气相色谱质谱（GC-MS）联用分析表明高山被孢霉Δ6-脂肪酸脱氢酶基因在毕赤酵母中获得表达,γ-亚麻酸含量占总脂肪酸的16.26%。     

大肠杆菌磷酸甘油酸脱氢酶突变体的构建及抗反馈抑制效应

磷酸甘油酸脱氢酶(D-3-phosphoglycerate dehydrogenase,PGDH,EC 1.1.1.95)为L-丝氨酸合成途径的关键酶,其编码基因为ser A,其活性受到合成产物L-丝氨酸的反馈抑制调控。为解除丝氨酸的反馈抑制,采用定点突变技术把编码PGDH酶344位组氨酸或346位天冬氨酸或364位天冬氨酸的密码子定点突变为丙氨酸密码子。改造后的ser AFbr被连到表达载体pT7-7上,并转入大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中进行表达,破壁回收粗酶液,通过DEAE阴离子柱纯化PGDH突变体,并对其酶活性和IC_(50)值进行了测定。结果,野生型PGDH酶IC_(50)值为7μmol/L,而PGDH双突变体N346A/H344A催化活性与野生型相近,在丝氨酸浓度为160 mmol/L时,其酶活仍保持未添加丝氨酸时酶活的96%,基本解除反馈抑制。     

高浓度2-KLG对氧化葡萄糖酸杆菌WSH-003中2-KLG合成途径关键基因表达的影响

【目的】研究高浓度的2-KLG对其生产菌株氧化葡萄糖酸杆菌生产过程中关键的脱氢酶合成基因、辅因子合成基因及其转运蛋白编码基因的影响。【方法】测定高浓度梯度2-KLG下氧化葡萄糖酸杆菌的生长情况,确定合适的添加浓度对氧化葡萄糖酸杆菌进行胁迫。使用实时定量PCR技术检测2-KLG合成中关键山梨醇脱氢酶基因sld AB、关键辅因子PQQ合成基因pqq ABCDE及5个潜在转运蛋白合成基因的变化。【结果】根据氧化葡萄糖酸杆菌在2-KLG高浓度梯度下生长测定实验结果,选定40、80和120 g/L 2-KLG作为添加浓度。实时定量PCR结果显示,在高浓度的2-KLG压力下,PQQ合成基因pqq ABCDE未受到显著影响,山梨醇脱氢酶基因sld AB以及部分PQQ潜在转运蛋白编码基因的表达均显著下调。【结论】高浓度2-KLG会抑制氧化葡萄糖酸杆菌中山梨醇脱氢酶基因的表达,有可能会影响辅酶PQQ的转运,但不会显著影响辅酶PQQ的合成。