乙肝病毒突变核心蛋白基因的克隆及序列分析

目的克隆发生长片段缺失的乙肝病毒核心蛋白基因（HBV-C）,并对其进行DNA序列和蛋白质结构分析。方法通过PCR从1株乙型肝炎病毒中扩增得到发生长片段缺失的HBV-C基因,利用TA克隆将PCR产物克隆人pUCm—T载体并进行测序、同源性比较和蛋白质结构分析。结果PCR扩增出的HBV-C基因经序列分析表明长度为454bp,其核苷酸序列缺失了220—317bp之间的98个碱基,造成从74个氨基酸起发生移码突变。结论成功克隆发生长片段缺失的HBV-C基因,为表达及功能研究奠定了基础。     

利用pSOS系统筛选靶向HBV病毒X基因的siRNA

构建靶向乙肝病毒(HBV)X基因的真核表达载体pSOS-X-siRNA和pSOS-siRNA,转染肝癌细胞系HepG2和HepG2.2.15,筛选和验证高效siRNA。设计4个靶向X基因siRNA,将siRNA和HBx基因插入载体pSOS得重组质粒pSOS-X-siRNA;pSOS-X-siRNA经PacI酶切去除目的片段HBx后得pSOS-siRNA。将质粒pSOS-X-siRNA和pSOS-siRNA分别转HepG2和HepG2.2.15肝癌细胞株。荧光显微镜下观察HepG2细胞绿色荧光(GFP)减弱程度预估干扰效率。ELISA检测HepG2.2.15细胞上清HBsAg、HBeAg表达,Western blotting检测胞内蛋白HBsAg、HBcAg表达,Real time PCR检测胞内HBsmRNA、HBx mRNA的转录。转染4d后,siRNA4使HepG2细胞的GFP信号表达程度最低,为阴性对照的9%,预测其干扰效果最强。siRNA4使HepG2.2.15细胞转染后4d上清的HBsAg蛋白表达为对照的(13.92±1.14)%(P0.05)、HBeAg为(21.69±4.92)%(P0.05),胞内的HBsAg、HBcAg蛋白表达量灰度比值为0.175±0.025、0.0825±0.028,均为各处理组中最低(P0.01),HBs mRNA和HBx mRNA分别降为对照的0.237±0.028(P0.01)、0.110±0.022(P0.01),差异有统计学意义,证实siRNA4为高效干扰位点。利用pSOS成功筛选并验证构建靶向HBV X基因的siRNA靶点。     

鱼山镇1岁以上人群不同年龄组乙肝表面抗原携带率与乙肝疫苗接种关系的调查

研究鱼山镇乙肝疫苗接种率不同人群的乙肝病毒表面抗原(HBsAg)携带率的差异。将该镇所有户籍登记在册人员按出生日期分成3组,再按随机抽样法对每个年龄组抽取一定数量的人组成样本,调查乙肝疫苗接种史;对每位参加者采集静脉血5ml,无菌分离血清,使用固相放射免疫试剂和酶联免疫试剂检测乙肝病毒表面抗原和抗乙肝病毒表面抗原抗体(HBsAb,抗-HBs)。小年龄组、中年龄组、大年龄组乙肝疫苗接种率依次为80.00%、50.46%、25.36%,差异具有统计学意义(χ2=262.24,P<0.005);小年龄组、中年龄组、大年龄组HBsAg携带率依次为2.07%、11.93%、17.87%,差异具有统计学意义(χ2=77.48,P<0.005);小年龄组、中年龄组、大年龄组HBsAb依次为43.38%、24.77%、10.95%,差异具有统计学意义(χ2=107.28,P<0.005)。乙肝疫苗接种率在小年龄组、中年龄组、大年龄组依次降低,HBsAg携带率依次增高,HBsAb阳性率依次降低。因此,接种乙肝疫苗对人群有较好的保护作用,人群乙肝疫苗接种率越高,HBsAb阳性率越高,HBsAg携带率越低。     

HCV核心区与HBV核心区融合基因的DNA免疫

构建了在CMV启动子控制下在真核系统表达丙肝核心蛋白基因全长(HCc1 91 )及其氨端片段 (HCc6 9及HCc40 )的表达克隆 ,以及这 3种不同长度的HCc分别与乙肝核心区基因 (HBc1 44 )在羧端融合的表达克隆 .在COS细胞中实现了暂时表达 .ELISA和Westernblot分析表明 ,表达产物具HCc抗原性或同时具有HBc的抗原性 .非融合和融合基因的DNA直接免疫小鼠 ,能有效地产生抗HCc抗体或同时产生抗HBc抗体 .融合形式要比非融合形式产生抗HCc抗体的持续时间长 .结果表明不同长度的HCc的融合并不影响HBc免疫原性的表现 ,却有利于HCc免疫原性的表现 .     

高通量流式荧光微球悬液芯片检测乙肝病毒基因分型

目的:建立HBV基因分型高通量液相芯片检测技术,并探讨其应用价值.方法:对GenBank中收录的明确分型的HBV基因序列进行分析,选择preS2-S区设计引物和A、B、C和D型特异性探针.与荧光编码微球偶联的特异型探针与一条引物生物素标记的PCR产物直接杂交反应,然后结合亲和素标记的藻红蛋白,用流式检测仪(Bio-Plex 200)检测荧光信号.检测182份阳性乙肝患者血清DNA,其中35份样品检测结果与测序法比较.用B、C型质粒DNA倍比稀释及混合样品检测灵敏度来评估该方法.结果:建立了HBV基因分型的快速高通量液相芯片检测方法.182份患者血清检测结果为:B型占24.2％ (44/182),C型占71.4％(130/182),D型为6.6 ％(12/182),BC混合型4.4％(8/182).其中35份样本与测序法比较,除3份混合型测序法未检出外,其它32例结果均相同本方法的灵敏度检测下线为1×103 copies/mL.结论:应用悬液芯片技术进行乙肝病毒的基因分型分析,具有较好的特异性和较高的灵敏度,并有简便、灵活和高通量等优势.该检测系统不仅在科研中有广泛的前景,也有望成为临床推广的多重分子诊断和基因分型的新方法.     

乙型肝炎病毒x蛋白通过靶向miR-200c诱导DNA异常甲基化

乙型肝炎病毒x (hepatitis B virus x,HBx)蛋白是导致肝癌(hepatocellular Carcinoma,HCC)的重要因素.但HBX在HCC形成过程中表观遗传机制尚有待阐明.本研究发现microRNA-200c (miR-200c)在过表达乙型肝炎病毒的HCC中下调,并且其直接靶向DNA甲基转移酶3A (DNA methyltransferase 3A,DNMT3A).此外,miR-200c和DNMT3A在HB诱发的肝癌组织中呈现负相关.乙型肝炎病毒诱导miR-200c下调,进而引起DNMT3A表达上调,导致细胞中肿瘤相关基因的启动子超甲基化.我们对乙型肝炎病毒诱导的肝癌表观遗传学改变进行了进一步研究,并提出一种基于miRNA的靶向治疗乙型肝炎病毒相关肝癌的潜在方法.     

妊娠合并乙肝病毒感染患者血清DNMT1、TIM-3与HBV-DNA病毒载量和妊娠结局的关系分析

摘要 目的：探讨妊娠合并乙肝病毒（HBV）感染患者血清脱氧核糖核酸甲基转移酶1（DNMT1）、T细胞免疫球蛋白粘蛋白-3（TIM-3）与乙型肝炎病毒-脱氧核糖核酸（HBV-DNA）病毒载量和妊娠结局的关系。方法：选取2021年1月～2022年1月南京医科大学第一附属医院收治的186例妊娠合并HBV感染患者为HBV感染组,根据HBV-DNA病毒载量分为阳性组56例和阴性组130例,根据妊娠结局分为结局不良组和结局良好组,另选取同期于南京医科大学第一附属医院进行孕检的150名健康孕妇为对照组。采用酶联免疫吸附法检测血清DNMT1、TIM-3水平。比较HBV感染组与对照组、阳性组与阴性组血清DNMT1、TIM-3水平。采用单因素及多因素Logistic回归分析妊娠合并HBV感染患者妊娠结局不良的影响因素,受试者工作特征（ROC）曲线分析血清DNMT1、TIM-3水平对妊娠合并HBV感染患者妊娠结局不良的预测价值。结果：与对照组比较,HBV感染组血清DNMT1、TIM-3水平升高（P＜0.05）。与阴性组比较,阳性组血清DNMT1、TIM-3水平升高（P＜0.05）。186例妊娠合并HBV感染患者妊娠结局不良发生率为55.38%（103/186）。单因素分析显示,妊娠结局不良与HBV感染孕周、HBV-DNA病毒载量、谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）、DNMT1、TIM-3有关（P＜0.05）。多因素Logistic回归分析显示,HBV-DNA病毒载量阳性和DNMT1＞34.94 ng/mL、TIM-3＞18.96 pg/mL为妊娠合并HBV感染患者妊娠结局不良的独立危险因素（P＜0.05）。ROC曲线分析显示,血清DNMT1、TIM-3水平单独和联合检测预测妊娠合并HBV感染患者妊娠结局不良的曲线下面积分别为0.798、0.791、0.870。结论：妊娠合并HBV感染患者血清DNMT1、TIM-3水平升高与HBV-DNA病毒载量阳性和妊娠结局不良密切相关,血清DNMT1、TIM-3水平联合对妊娠合并HBV感染患者妊娠结局预测价值良好。