表达毒素源性大肠杆菌定居因子抗原CS6的一组基因的克隆

人源毒素源性大肠杆菌(Enterotoxigenic E.Coil ETEC)是引起婴幼儿及旅游者腹泻的主要致病菌。ETEC的致病因子包括定居因子抗原 (Colonization factor antigens,CFAs)和肠毒素。大多数ETEC菌株均能产生抗原特异的菌毛,介导细菌与宿主小肠粘膜表面并在粘膜表面上受体的结合,使得细菌能定殖于粘膜表面并在粘膜的功能性清除中存活下来。已经报道的定居因子抗原包括CFA/Ⅰ,CFA/Ⅱ、CFA/Ⅲ、CFA/Ⅳ(PCF8775)、PCF09和PCFO159等。CFA/Ⅰ和CFA/Ⅲ均由单一的菌毛亚基构成,CFA/Ⅱ、CFA/Ⅳ则由多种表面抗原(colisurface antigen,CS)复合而成。所有的CFA/Ⅳ阳性菌株均表达CS6抗原,其中有些同时表达CS4或CS5抗原。CS4和CS5都是直径6～7nm的菌毛,能引起人和牛血红细胞的甘露糖抗性的凝集反应(MRHA)。迄今为止,没有观祭到CS6明显的菌毛结构,CS6也不能引起MRHA阳性反应。然而动物实验的结果表明,CS6是CFA/Ⅳ复合抗原中一种对定居作用最重要的抗原”,。本研究组已经通过分子克隆的手段获得了能分别表达CFA/Ⅰ和CS3抗原的重组菌株,用于人源ETEC疫苗的研究。本文报道了表达CS6菌毛抗原的DNA片段的克隆,并用免疫吸附制备的CS6抗血清测定了重组菌株表达的菌毛蛋白。     

大肠杆菌冷休克蛋白CspC的分离纯化及部分性质测定

经Sepharose Q Fast Flow阴离子交换层析和Superdex 30凝胶过滤层析,从大肠杆菌（Escherichia coli）细胞内分离纯化了一种小分子蛋白质，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)纯度鉴定为单一条带，经质谱分析、N端测序、同源序列比较，确定该蛋白质为大肠杆菌冷休克蛋白CspC.在此基础上，用圆二色光谱测定了其二级结构含量，初步探索了其热稳定性及与单链DNA结合后的构象变化.     

载脂蛋白A-Ⅰ通过PKA信号途径影响ABCA1的表达与功能

以THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞为研究对象,观察载脂蛋白A-Ⅰ与三磷酸腺苷结合盒转运体A1(ATP binding cassette transporter A1,ABCA1)的相互作用,并探讨它们相互作用的机制,以便了解载脂蛋白A-Ⅰ和ABCA1在动脉粥样硬化发生发展中的作用.THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞经各种因素处理后,采用油红“O”染色,观察细胞内的脂滴,运用液体闪烁计数器检测细胞内胆固醇流出,高效液相色谱分析细胞内总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯含量,用逆转录-聚合酶链反应和蛋白质印迹分析法分别检测ABCA1 mRNA与ABCA1蛋白质的水平.实验结果显示,载脂蛋白A-Ⅰ和腺苷酸环化酶激动剂Forskolin(FRK)引起THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞总胆固醇、游离胆固醇与胆固醇酯减少,而腺苷酸环化酶抑制剂SQ-22536引起THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞总胆固醇、游离胆固醇与胆固醇酯增加.载脂蛋白A-Ⅰ引起THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1蛋白质水平和细胞内胆固醇流出增加.FRK引起THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1蛋白质水平和细胞内胆固醇流出呈时间和浓度依赖性增加.SQ-22536引起THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1蛋白质水平和细胞内胆固醇流出减少.结果提示,载脂蛋白A-Ⅰ可提高THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞ABCA1蛋白质水平,增加细胞内胆固醇流出,降低细胞内胆固醇聚积.其机制可能是通过PKA信号途经使细胞ABCA1蛋白质水平增加.     

α-黑色素细胞刺激素对白细胞介素-1β发热的解热机理研究

本研究观察了α－黑色素细胞刺激素（α－ＭＳＨ）对家兔白细胞介素－１β（ＩＬ－１β）发热效应及下丘脑组织腺苷环－磷酸（ｃＡＭＰ）含量的影响;同时观察了下丘本外培养过程中,α－ＭＳＨ对ＩＬ－１β刺激下丘脑释放ｃＡＭＰ的影响。结果显示：α－ＭＳＨ能显著降低ＩＬ－１β引起的体温升高（Ｐ〈０．０５）;同时抑制下丘脑组织ｃＡＭＰ含量的增高（Ｐ〈０．０１）。ＩＬ－１β与下丘脑组织培养,其上清液的ｃＡＭＰ含量明显     

大肠杆菌CusS的生物信息学分析及对银离子胁迫的响应

【目的】解析大肠杆菌(Escherichia coli) K-12菌株同型二聚体内膜传感器组氨酸激酶(sensor histidine kinase, CusS)蛋白在细菌应答金属银离子胁迫中的调控机制,为该菌的防治提供重要科学依据。【方法】利用ProtParam、ProtScale、Protein-Sol、TMHMM、SignalP、LocTree3、NetNGlyc-1.0、NetPhosBac-3.0、SOPMA、I-TASSERF、STRING和MEGA分别预测CusS的理化性质、亲水性、可溶性、跨膜域、信号肽、亚细胞定位、糖基化位点、磷酸化位点、二级结构、三级结构、蛋白互作的关系网络和蛋白在革兰阴性杆菌中的同源性。采用Red同源重组技术构建大肠杆菌ΔcusS,在不同培养基中连续监测ΔcusS的生长情况,观察该基因缺失后的细菌生长活性;通过最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration, MIC)试验评价该缺失株对金属铜、银离子和临床常见抗生素的敏感性变化;运用RT-qPCR检测cusS缺失后其下游基因cusCFBA和cusR转录水平。【结果】CusS蛋白由480个氨基酸组成,相对分子质量为53 738.05,原子总数为7 624,等电点为6.02,具有稳定性,是一种亲水性、不溶性蛋白;含有跨膜域;不存在信号肽,定位于细胞内膜中;存在2个糖基化位点、24个丝氨酸磷酸化位点、14个苏氨酸磷酸化位点和3个酪氨酸磷酸化位点;二级结构中α-螺旋占比55.42%,β-折叠占比11.67%,β-转角占比3.75%,无规则卷曲占比29.17%;cusS在埃希菌属和志贺菌属中的保守性高;菌落PCR和一代测序验证ΔcusS构建成功;连续检测生长曲线表明cusS缺失并不影响细菌的生长代谢,但CusS蛋白为大肠杆菌抵御金属银胁迫的关键基因。【结论】cusS作为一个关键基因,它的缺失并不影响大肠杆菌的生长活性,但会显著降低细菌抵御银离子胁迫的应答能力。缺失cusS将使下游基因cusCFBA和cusR的mRNA表达水平显著下降。对CusS蛋白进行生物信息学分析及表型初探,为深入了解CusS在大肠杆菌应答银离子胁迫的调控机制奠定了基础。     

取食和交配对苹小吉丁飞行能力的影响

【目的】苹小吉丁Agrilus mali是一种严重危害苹果树的钻蛀性害虫。本研究旨在明确苹小吉丁的飞行扩散能力及对其飞行能力产生影响的关键因子。【方法】以SUN-FL型智能飞行磨系统对苹小吉丁不同日龄雌雄成虫的飞行能力进行了测定,同时评价了取食和交配情况对其飞行能力的影响。【结果】苹小吉丁飞行能力均随日龄的增加先增强后逐渐降低,初羽化的成虫飞行能力最低,11日龄成虫的飞行能力最强。雌成虫飞行能力强于雄成虫。在24 h内雌雄成虫的最长飞行距离分别为0.4165和0.3559 km;最长飞行时间分别为0.4582和0.4873 h;最大飞行速度分别为2.4639和1.8561 km/h。取食的3日龄雌成虫的平均飞行距离和平均飞行时间分别为0.047 km和0.048 h,雄成虫的分别为0.044 km和0.042 h;而未取食的雌成虫平均飞行距离和平均飞行时间仅分别为0.016 km和0.013 h,雄成虫的仅分别为0.013 km和0.012 h。交配对飞行能力的影响存在性别差异,已交配雌成虫的飞行能力要强于未交配雌成虫的,而已交配雄成虫的飞行能力却低于未交配雄成虫的。【结论】日龄对苹小吉丁成虫的飞行能力影响作用显著。取食显著提高苹小吉丁雌雄成虫的飞行能力,交配显著提高雌成虫飞行能力。     

携带Paenibacillus polymyxa WLY78固氮基因簇(nif)的重组大肠杆菌Escherichia coli78-7转录组分析

[目的]来自Paenibacillus polymyxa WLY78的固氮基因簇（nifBHDKEfNXhesAnifV）可以转化入Escherichia coli中表达并使重组大肠杆菌合成有固氮活性的固氮酶。本文拟通过对重组大肠杆菌E.coli 78-7的转录组分析以提高其固氮能力。[方法]对固氮条件（无氧无NH₄⁺）和非固氮条件（空气和100 mmol/L NH₄⁺）培养的重组大肠杆菌E.coli 78-7进行转录组分析。[结果]nif基因在两种培养条件下显著表达,说明在重组大肠杆菌中可规避原菌中氧气和NH₄⁺对nif基因的负调控。对于固氮过程必需的非nif基因,如参与钼、硫、铁元素转运的mod、cys和feoAB,这些基因在两种培养条件下表达水平有差异。而参与铁硫簇合成的suf和isc基因簇在两条件下表达水平差异巨大。此外,参与氮代谢的基因在固氮条件下显著上调。[结论]重组大肠杆菌中与固氮相关的非nif基因在该菌的固氮过程中具有较大影响,本文对在异源宿主中调高固氮酶活性研究具有重要意义。     

铁还原细菌Shewanella oneidensis MR-4诱导水合氧化铁形成蓝铁矿的过程

【目的】研究铁还原细菌Shewanella oneidensis MR-4在细胞外诱导形成含铁矿物的矿物相、化学成分和形貌结构等特性及其变化,深化对铁还原细菌细胞外诱导矿化过程的认识。【方法】在以30 mmol/L乳酸钠为电子供体,10 mmol/L水合氧化铁为电子受体,[HCO_3~–]为30 mmol/L,[PO_4~(3–)]为5 mmol/L条件下,30°C恒温下厌氧培养,进行细菌生长和细胞外诱导矿化实验,定期采样测量反应体系的pH、生物量、Fe(Ⅱ)浓度;采用激光拉曼光谱(Raman)、扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)和X-射线衍射(XRD)等方法对不同时间点的矿化产物进行分析。【结果】MR-4在还原Fe(Ⅲ)的过程中,细胞快速生长,表明MR-4的Fe(Ⅲ)还原和乳酸氧化过程相互耦合,从而进行细胞生长,并在细胞外诱导矿物形成。对不同阶段矿化产物的综合分析表明,反应进行到约8 d时,无定形-弱结晶的水合氧化铁部分地转化为纳米尺寸的磁铁矿晶体颗粒;约16 d时,反应体系中开始出现蓝铁矿晶体颗粒;约20 d后,几乎所有矿物转化为纤维状或者叶片状的蓝铁矿。【结论】铁还原细菌Shewanella oneidensis MR-4细胞外诱导矿化过程受环境条件控制,当以乳酸钠和水合氧化铁分别作为电子供体和受体,相对高的[PO_4~(3–]/[HCO_3~–](1:6)时,水合氧化铁先转化为磁铁矿,最后大量转化为蓝铁矿。本研究为全面认识铁还原细菌的生物诱导矿化过程和评估其参与铁元素地球化学循环提供了新的数据。     

大肠杆菌生产异戊二烯的代谢工程研究进展

异戊二烯作为一种重要的化工原料,主要用于合成橡胶。此外,还广泛应用于医药或化工中间体、食品、粘合剂及航空燃料等领域。利用微生物法生产异戊二烯因具有环境友好、利用廉价的可再生原料、可持续发展等优势而成为当今研究的热点。这里介绍了大肠杆菌生产异戊二烯的代谢途径及关键酶,从代谢工程的角度出发综述了目前为提高大肠杆菌异戊二烯产量所应用到的方法和策略,并对今后的发展方向进行了展望。