一种新的线粒体基因组DNA捕获探针的制备及初步应用

目的:建立新的线粒体基因组DNA杂交捕获探针制备方法并用进行初步应用。方法:通过PCR技术扩增特异线粒体DNA片段,并与生物素偶联,最后与标记磁珠的亲和素混合获得捕获探针。并自行制备的线粒体基因组DNA文库捕获探针与肝癌全基因组测序文库进行液相杂交。分离捕获产物后PCR扩增并进行测序分析。结果:成功建立了线粒体基因组杂交捕获探针制备方法并成功分离线粒体基因组DNA;对测序数据的分析显示:90%以上测序数据来自线粒体基因组DNA,且覆盖率达到100%,且均一性良好。检测到的同质性变异位点数量和异质性变异位点数量与全基因组测序数据产生的结果接近(P=0.9152,P=0.8409)。结论:新方法制备的线粒体基因组DNA杂交捕获探针可以从全基因组文库中高效捕获线粒体基因组DNA测序文库。     

基因测序技术的发展以及对个体化用药水平提高的影响

自基因测序技术发明之时起,就已开始运用在生命科学的研究中,对揭示生命本质的研究起到了关键作用。基因测序技术的运用推动了生命科学的发展,并由此引申了更多的科学问题;人们对未知领域的渴求又推动了基因测序技术的进步,发展出更高速、更低价的新技术。随着测序技术的逐步应用,临床个体化用药的水平有了极大的提高。基因测序技术目前已经成功应用于遗传基因多态性标志物的筛选中,使基因导向的合理用药成为可能;还成功应用于疾病组织突变位点标志物的筛查中,使肿瘤靶向用药成为可能;在病原体耐药基因突变检测中的应用,使基于细菌或病毒耐药突变的个体化用药成为可能。随着测序技术向更高通量、更高精度、更低成本的方向发展,基于基因检测的个体化健康时代将会到来。     

医院相关性ST5型耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ZJ5499的全基因测序及序列分析

目的对1例医院获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)肺炎患者血中分离的1株MRSA(ZJ5499)进行基因组序列信息解析。方法采用Illumina平台高通量测序和Sanger测序相结合对ZJ5499菌株进行全基因组测序,并使用相关软件对序列进行拼接、基因预测、功能注释、直系同源簇注释(COG)及毒力因子和耐药基因分析;并与国内常见流行序列型(ST型)菌株进行进化关系分析、毒力因子和耐药基因比较。结果 ZJ5499菌株基因组大小为2 888 783bp,GC含量32.84%,序列已提交至GenBank数据库,登录号为CP011685。该菌株基因组中含有大量与致病性相关的毒力因子,并含有spc、aadD、mecA、norA和erm(A)五个耐药相关基因,与同一ST型菌株基本一致。进化关系分析显示该菌株与同一ST型菌株关系较近。毒力因子与ST5型菌株没有较大差异,而较其他ST型明显增多。结论本研究报道了临床MRSA菌株ZJ5499的全基因组序列。序列分析发现该菌株的毒力和耐药性与ST5型的菌株相近,而ST5型菌株较其他国内流行ST型菌株携带较多毒力基因。     

甲硝唑治疗细菌性阴道病前后阴道菌群的结构变化及其预后相关性

目的研究经甲硝唑规范治疗的细菌性阴道病患者在用药后6~8d随访时的菌群结构与治疗前以及治疗结局之间的关系,探讨治愈人群与治疗失败人群在6~8d这一观察点的阴道菌群多样性的差异,从而为实现细菌性阴道病治疗结局的预测提供理论依据。方法选取2012年9月至2013年7月在北京大学第一医院妇产科门诊诊断为细菌性阴道病的育龄期女性为研究对象,规范使用甲硝唑凝胶治疗,分别采集患者用药前、用药后6~8d、用药后1个月的阴道分泌物,提取细菌组DNA,进行454焦磷酸测序,分析阴道微生物菌群的多样性和丰度差异,探讨细菌性阴道病患者阴道菌群的构成差异与预后之间的相关性。结果共61名患者完成了2次随访,共计183份阴道分泌物样品。对所有采集的标本进行454焦磷酸测序分析,共发现192种细菌。用药后6~8d的革兰染色涂片结果显示所有患者的阴道菌群镜下可分为三种情况:正常菌群、菌群抑制、异常菌群。镜检涂片为正常菌群的治愈率最高,其次是菌群抑制,异常菌群的治愈率最低。454焦磷酸测序分析显示甲硝唑治疗前后菌群的多样性和丰度发生了一定程度的变化,乳杆菌和球菌的含量未受明显影响,而细菌性阴道病致病菌的含量明显减少。结论甲硝唑可以有效减少细菌性阴道病致病菌的数量而不影响乳杆菌的含量,但是对以球菌为主的患者治疗效果差。对高通量测序结果和革兰染色涂片结果的综合分析显示甲硝唑用药后6~8d的阴道菌群对细菌性阴道病1个月后的治疗结局具有预测价值。     

基于高通量测序的慈竹笋转录组分析与基因功能注释

慈竹是我国四川当地的优势丛生竹种之一,其纤维长度和质量较优异,是造纸、纺织等工业的良好原料。本文利用Illumina Hi SeqTM 2000平台,对10、50、100和150 cm高的慈竹笋进行转录组分析,共得到69.28 M条读长(Reads),经从头拼接、组装和聚类后得到111 137条非重复序列基因Unigene,其中共有63 094条注释到COG、GO、KEGG、Swiss-Prot和Nr数据库中。这些Unigene不仅具有一般的功能,如转录和信号转导等,还涉及到蔗糖转运与代谢、次级代谢产物及细胞壁的生物合成等方面。不同高度慈竹笋的纤维素合成酶基因存在差异表达,发现了可能调控慈竹生长发育以及纤维素和木质素生物合成的相关基因,为慈竹品种改良提供一定的理论基础。     

三峡库区支流蓝藻水华对浮游细菌群落组成的影响

为探究蓝藻水华生消过程对浮游细菌群落组成的影响, 对三峡库区小江支流进行了采样检测, 结果表明小江采样点的水华优势蓝藻主要为水华鱼腥藻和铜绿微囊藻, 水华中期藻细胞密度分别达6.22109和8.77108个/L, 占总生物量的67%和26%。水华中、末期, 浮游细菌群落变化显著。其中, 水华中期主要以玫瑰单胞菌(Roseomona)等属细菌为主, 水华末期则以芽孢杆菌(Bacillus)等属细菌为优势, 且变形菌门(Proteobacteria)及放线菌门(Actinobacteria)细菌相对丰度明显增加, 暗示了细菌群落组成与库区支流蓝藻水华生消变化可能具有相关性。     

野生圆口铜鱼卵巢成熟内分泌信号表达分析

圆口铜鱼(Coreius guichenoti)是一种呈群同步发育繁殖的鱼类, 对其卵巢成熟各时期特征分析, 可进一步了解鱼类卵巢成熟的分子调控机制, 并为人工催产实践提供理论支持。研究以野生雌性圆口铜鱼不同发育时期的卵巢为研究对象, 通过现场卵巢解剖观察以及实验室内组织学分析, 收集处于Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ期的卵巢组织样本进行转录组分析。研究显示野生圆口铜鱼卵巢组织在其成熟发育各阶段具有明确的组织学和转录表达特征。研究采用全序列转录组测序分析, 以鲤科模式鱼类斑马鱼的基因序列作为主要参考序列, 共检测得到11 495 bp基因片段。聚焦内分泌/自分泌信号分子的转录表达, 发现促乳素(Prolactin, prl)、卵泡刺激素(Follicle-stimulating hormone, fsh)、雌激素(Estrogen)、前列腺素E2(Prostaglandin E2, PGE2)合成酶类、生长/分化因子9(Growth/differentiation factor 9, gdf9)、激活素(Activin)、和抗穆氏管激素(Anti-Mllerian hormone,amh)等转录表达和卵巢发育成熟呈现出显著的关联动态变化。通过对样品中卵巢成熟诱导激素(Maturationinducinghormone, MIH)合成酶分子的表达水平的观察, 发现涉及MIH的17, 20-dihydroxy-4-pregnen-3-one的合成酶分子表达水平较高, 而另一种MIH分子11-deoxycorticosteron的合成酶的表达水平处于检测水平之下,因此, 提示17, 20-dihydroxy-4-pregnen-3-one可能是圆口铜鱼卵巢成熟后期的主要促进因子。同时, 发现了完整的胆酸合成酶系列分子在卵巢转录组中的存在, 这是鱼类卵巢组织中具有合成胆酸能力的首次报道, 其生理作用有待进一步研究。总之, 作为一种群同步发育的鱼类, 此项研究为鱼类卵巢成熟发育过程中的内分泌信号调控网络提供了大量的数据参考。     

虾-贝-红树林耦合循环水养殖系统中微生物群落分析

海水循环水养殖系统是重要的生态养殖模式发展趋势之一, 为了深入了解循环水养殖生态系统, 通过对系统各功能区水体中细菌16S rRNA基因V4V5区进行高通量测序和生物信息学分析, 从微生物生态学角度分析了循环水养殖系统不同功能区的细菌群落结构动态。测序分析结果显示, 海水循环水养殖系统中优势细菌种群分别属于变形菌门(Proteobacteria)、蓝藻门(Cyanobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、放线菌门(Actinobacteria)和浮霉菌门(Planctomycetes)。红树林湿地水体中变形菌门和厚壁菌门丰度较高, 而对虾养殖池的拟杆菌门和浮霉菌门丰度较高。在不同优势类群中, 变形菌门多样性指数平均值最高, 其次是拟杆菌门, 厚壁菌门最低。在各功能区中, 红树林细菌多样性最高, 虾池最低。MDS分析结果显示虾池、贝池和红树林湿地水体中细菌群落结构有明显差异, 虾池与其他功能区差异最大。研究表明, 高密度对虾养殖对虾池水体中细菌群落有显著影响, 但其影响在循环水养殖系统后续功能区中逐渐减弱。     

内蒙古大青山灌木铁线莲根围丛枝菌根真菌群落季节动态研究

采用Illumina MiSeq测序技术研究了内蒙古大青山干旱阳坡灌木铁线莲(Clematis fruticosa)根围丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)群落的季节动态,并利用冗余分析(redundancy analysis,RDA)和Mantel test分析了土壤和植被因子与AMF之间的关系,为进一步探索灌木铁线莲-AMF共生体对不同季节环境变化的响应提供理论依据。结果表明:(1)灌木铁线莲根围AMF孢子密度不存在显著的季节性差异,根系侵染率和丛枝丰度从春季至秋季呈下降趋势。(2)3个季节共检测出163个AMF OTUs(operational taxonomic units),春季、夏季、秋季分别为116OTUs、76OTUs和70OTUs。(3)夏季和秋季的AMF丰富度(实测OTUs数和Chao1指数)以及多样性(Shannon-Wiener指数和Invsimpson指数)显著低于春季,但夏、秋季间无显著异。(4)主成分分析和PERMANOVA分析表明,夏季和秋季的AMF群落组成与春季存在显著差异,而AMF群落组成在夏季与秋季间差异不显著。(5)RDA分析表明,采样季节、植被盖度、植物多样性、土壤含水量和土壤有机质对AMF ShannonWiener指数、Invsimpson指数、Chao1指数和实测OTUs数均产生显著影响;Mantel test分析发现,采样季节是影响AMF群落组成和菌根侵染率的主导因子,但对孢子密度无显著影响,而土壤有机质是影响孢子密度的主导因子。     

Identification of reference genes for qRT-PCR in human lung squamous-cell carcinoma by RNA-Seq

Although the accuracy of quantitative real-time polymerase chain reaction （qRT-PCR） is highly dependent on the reliable reference genes, many commonly used reference genes are not stably expressed and as such are not suitable for quantification and normalization of qRT-PCR data. The aim of this study was to identify novel reliable reference genes in lung squamous-cell carcinoma. We used RNA sequencing （RNA-Seq） to survey the whole genome expression in 5 lung normal samples and 44 lung squamous-cell carcinoma samples. We evaluated the expression proffies of 15 commonly used reference genes and identified five additional candidate reference genes. To validate the RNA-Seq dataset, we used qRT-PCR to verify the expression levels of these 20 genes in a separate set of 100 pairs of normal lung tissue and lung squamous-cell carcinoma samples, and then analyzed these results using geNorm and NormFinder. With respect to 14 of the 15 common reference genes （B2M, GAPDH, GUSB, HMBS, HPRT1, IP08, PGK1, POLR2A, PPIA, RPLPO, TBP, TFRC, UBC, and YWHAZ）, the expression levels were either too low to be easily detected, or exhibited a high degree of variability either between lung normal and squamous-cell carcinoma samples, or even among samples of the same tissue type. In contrast, 1 of the 15 common reference genes （ACTB） and the 5 additional candidate reference genes （EEFIA1, FAU, RPS9, RPSll, and RPSI4） were stably and constitutively expressed at high levels in all the samples tested. ACTB, EEFIAI, FA U, RPS9, RPSl l, and RPS14 are ideal reference genes for qRT-PCR analysis of lung squamous-cell carcinoma, while 14 commonly used qRT-PCR reference genes are less appropriate in this context.