传染性造血器官坏死病毒糖蛋白原核表达及免疫原性分析

为了建立传染性造血器官坏死病毒的免疫学检测方法,本研究以IHNV-Sn分离株基因组提取物为模板,利用RT-PCR方法扩增出其表面糖蛋白(glycoprotein,G)的基因序列(1527bp)。将该基因克隆到pET27b(+)表达载体中构建出重组质粒pET27b-G,通过大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株获得高效表达。SDS-PAGE电泳分析显示表达蛋白约55kD,大部分以包涵体的形式表达。利用尿素变性复性处理后获得高纯度的纯化蛋白,制备兔抗血清。间接ELISA结果显示,所制备的兔抗血清能够与重组糖蛋白和IHNV-Sn病毒株表面糖蛋白发生特异性反应,与重组蛋白的反应效价为1∶20 000;间接免疫荧光结果显示,该兔抗血清可与IHNV-Sn分离株和IHNV参考毒株产生特异性的荧光,以上结果说明本研究所表达的IHNV糖蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性,该研究为IHNV检测方法的建立及疫苗的研制提供了基础材料和理论依据。     

HPV16l1基因的克隆及其在真核细胞中的表达

克隆并表达人乳头瘤病毒16型(HPV16)晚期基因l1,以期为研制防治宫颈癌的DNA疫苗奠定基础。本实验采用PCR方法从质粒p16L1BN1中获得HPV16l1基因片段,利用基因重组技术,将其克隆至含巨细胞病毒(CMV)启动子的真核表达载体中,核酸序列鉴定HPV16l1基因真核表达质粒构建成功,再用脂质体介导基因转染7721人肝癌细胞。转化阳性细胞经SDS-PAGE显示在分子量大约为55kDa的位置出现一条特异性条带,与HPV16L1分子量大小相符。表达产物经Western blotting分析:能与HPV16L1单克隆抗体特异结合。真核表达质粒pcDNA3-HPV16L1构建成功并能在真核细胞7721中有效表达,为下一步进行动物DNA免疫实验奠定了基础。     

半嵌套式PCR技术区别检测犬细小病毒疫苗株和强毒株的研究

Two pairs of PCR primers were designed according to the sequances of the vaccine strain and virulent strain of CPV. Heminested PCR method was established. Result of the first PCR amplification showed the same amplified products of 574bp length, after the second PCR amplification, the virulent strain produced the length 364bp fragment, but the vaccine strain couldn' t produce that. The products of PCR were examined by electrophoresis and restriction enzyme digestion. The result showed the length of the fragment and enzyme sites were as the same as those designed. The PCR assay of CPV was proved to be specific and sensitive. It shows that this method may be used in discriminating the vaccine strain and virulent strain of CPV or monitoring the vaccinated canine in order to aviod disease and financial losing.     

稳定表达RFP-GFP-LC3的大鼠胰岛β细胞株的构建

为了简便自噬相关机理药物在胰岛β细胞上的高通量筛选,实验通过慢病毒转染技术,将RFP-GFP-LC3质粒转入大鼠胰岛β细胞株(RIN-m5f),用G418对感染细胞进行筛选,激光共聚焦进行活细胞拍摄验证,得到100%表达RFP-GFP-LC3质粒的细胞株。无血清饥饿处理细胞,结果显示:饥饿组GFP/RFP荧光点比值较对照组下降, P62蛋白表达量以及S6K磷酸化水平降低,加入10μmol/L氯喹部分抑制自噬后, GFP/RFP荧光点比值回升。以上结果表明稳定表达RFP-GFP-LC3的RIN-m5f构建成功,并能够以简单的检测方式准确表达自噬全过程,为自噬在糖尿病药物机理方面的研究奠定了基础。     

早幼粒白血病蛋白核体与病毒感染

早幼粒白血病蛋白核体（promyelocytic leukaemia nuclear bodies,PML-NBs）是哺乳动物细胞中普遍存在的一种动态的细胞核亚结构,参与DNA损伤与修复、细胞衰老与凋亡、基因表达调控以及肿瘤发生与抑制等多种重要的细胞活动。研究表明,PML-NBs也是多种病毒入侵细胞的作用靶点。PML-NBs通过介导细胞固有免疫反应或者作为细胞干扰素信号通路元件参与宿主细胞的抗病毒防御活动。该文以几种DNA和RNA病毒为例,综述了在病毒感染过程中PML-NBs与病毒的相互作用以及这些相互作用的功能意义,从而揭示PML-NBs在抵御病毒感染和免疫反应中的重要作用,并提出运用病毒单分子实时示踪（Single-virus Tracking）这一新技术深入研究PML-NBs在病毒感染中作用的可行性。     

用磁性分离RNA直接进行逆转录PCR

逆转录PCR(RT-PCR)技术是将提取的IRNA先逆转录为cDNA,然后再对该cDNA进行PCR扩增。该技术不仅可用于各种内源及外源性正常及异常RNA的分析或检测,而且还常用于cDNA文库的构建及特定基因的制备。RT-PCR所用RNA模板一般是未经纯化的总RNA,若RNA模板含量较低便难以     

小鼠RNA干扰基因RelA慢病毒载体的构建与鉴定

目的：构建小鼠RelA 基因的RNA 干扰慢病毒载体,转染小鼠成骨样细胞并鉴定。方法：针对小鼠RelA 基因序列,设计特异 性的shRNA 序列,应用基因重组技术插入慢病毒载体GV-248。得到的重组质粒转化感受态大肠杆菌DH5-alpha,筛选得到阳性克隆 并扩大培养。所得质粒进行测序分析确定载体构建成功。重组质粒载体及包装辅助质粒转染293T 细胞,得到目的病毒并测定相 应病毒滴度。慢病毒转染MC3T3-E1 细胞后,Real-time PCR 及Western blot 检测MC3T3-E1 细胞RelA 基因及成骨相关基因 ALP、OCN、RANKL的表达。结果：成功构建小鼠RelA 基因的RNA干扰慢病毒载体,感染MC3T3-E1 细胞后,RelA 基因的表达 明显受到抑制,同时RANKL基因表达水平明显下降,ALP、OCN基因表达水平明显上升。结论：成功构建了小鼠RelA 基因的 RNA 干扰慢病毒载体。当小鼠成骨细胞RelA基因表达被干扰,NF-资B 通路被抑制后,小鼠成骨细胞成骨相关基因ALP、OCN的 表达明显上升,成骨功能增强;同时RANKL 的表达明显下降,其介导的破骨细胞骨吸收功能减弱。     

EB病毒相关疾病与免疫应答

ＥＢ病毒感染引起的相关疾病有传染性单核细胞增多症、Ｘ连锁淋巴细胞增殖综合征、伯基特淋巴瘤、鼻咽癌、移植后淋巴细胞增殖病、腮腺癌、霍奇金病等。针对ＥＢ病毒膜抗原ｇｐ８５抗体有中和作用。针对ｇｐ３５０抗原的抗体与抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用有关。在限制ＥＢ病毒感染的Ｂ细胞增殖过程中,ＣＤ４＾＋Ｔ细胞和ＣＤ８＾＋Ｔ细胞起重要作用。