重组腺相关病毒(rAAV)介导的人凝血因子IX高活性突变衍生物在血友病B基因治疗研究中的应用

采用定点诱变技术,将R338A点突变引入人凝血因子Ⅸ基因,并构建于AAV载体上,以rHSV/AAV杂合辅助病毒系统介导制备rAAV-hFIX重组病毒,然后,经肌肉注射对血友病B小鼠进行治疗实验,观察该突变基因在小鼠体内的表达、活性以及机体对该突变衍生物的免疫反应与治疗效果.结果显示:(i)治疗小鼠体内可检测到hFIX-R338A突变衍生物的存在,并持续15周以上;(ii)突变衍生物hFIX-R338A在小鼠血浆中的凝血活性达(34.2±5.23)%,显著高于野生型Ⅸ因子凝血活性((14.27±3.4)%);(iii)治疗小鼠体内未检测到抗Ⅸ因子突变衍生物抗体的存在;(iv)未发现与治疗相关的局部及全身性毒副作用.提示:以AAV介导人凝血因子Ⅸ高活性突变衍生物hFLX-R338A基因治疗可能成为替代野生型Ⅸ因子进行血友病B基因治疗的一个更为有效的途径.     

利用假型反转录病毒对大部分胰腺切除后再生细胞的世系追踪

胰腺是一个重要的内外分泌混合腺, 胰腺发生损伤后能够再生。为了探讨胰腺活体细胞世系追踪的方法和胰腺损伤后再生细胞的来源,分别通过胰腺伤口涂抹并胰内注射、尾静脉注射及腹腔注射三种方法, 利用假型反转录病毒对成体小鼠大部分切除后胰腺的细胞进行世系追踪。结果发现在活体条件下, 与尾静脉注射及腹腔注射法相比, 胰腺伤口涂抹并胰腺内注射反转录病毒的方法能够更有效的标记胰腺细胞; 而且, 通过对标记细胞的世系追踪研究证明, 在胰腺损伤后, 胰腺腺泡细胞能够接受损伤信号刺激发生再生。为今后进一步利用反转录假病毒对活体胰腺进行细胞命运追踪研究奠定基础, 为利用反转录病毒载体进行胰腺疾病的基因治疗提供线索。     

结核病人感染人类免疫缺陷病毒导致血浆中和结核分枝杆菌诱生的细胞因子变化

在全球感染性疾病中,结核病仍是导致死亡的最普遍的原因之。人类免疫缺陷病毒(HIV)感染与结核病有着密切联系,它能加剧结核病的发展,结核病又可促进HIV的复制,加速艾滋病的发作。机体对结核分枝杆菌(简称结核杆菌)的抵抗主要依赖细胞免疫,T细胞产生的细胞因子与结核杆菌感染密切相关。Th1细胞活化分泌IFN—r,激活巨噬细胞对控制感染起着重要作用。     

Tet-On3G系统调控人巨细胞病毒蛋白pUL23稳定表达的人胚肺成纤维细胞(HELF)系的建立

人巨细胞病毒(Human cytomegalovirus,HCMV)为疱疹病毒家族一员,易导致免疫力低下或缺陷的人群严重疾病,目前对HCMV编码的皮层蛋白pUL23功能的相关报道很少。本研究应用Tet-On3G诱导表达系统,在人胚肺成纤维细胞(Human embryonic lung fibroblast,HELF)建立诱导表达HCMV病毒蛋白pUL23细胞模型。将病毒基因UL23和阳性对照基因EGFP分别定向插入应答慢病毒载体pLVX-TRE3G中,获得pLVX-TRE3GUL23-3×Flag、pLVX-TRE3G-EGFP重组慢病毒载体。运用二代慢病毒包装系统与Lenti-X293T包装细胞系,制备收获慢病毒后感染人胚肺成纤维细胞HELF。遗传霉素(Geneticin,G418)和嘌呤霉素(Puromycin,Puro)抗性筛选后多西环素(Doxycycline,Dox)诱导外源基因表达。感染后的细胞在96孔板有限稀释法成单克隆,分别采用RT-PCR与Western blot技术检测病毒UL23基因在mRNA水平与蛋白水平的表达量,筛选出当诱导时高效表达且未诱导时低表达的单克隆细胞;并评估Dox诱导剂量与诱导时间对外源蛋白pUL23表达的影响。限制性内切酶与测序显示重组质粒pLVX-TRE3G-UL23-3×Flag、pLVX-TRE3G-EGFP序列和方向正确。病毒蛋白pUL23在感染细胞中能够被诱导表达;当Dox浓度高于400ng/mL时pUL23蛋白表达量不再随Dox剂量增高而增高。在Dox诱导2h后,RT-PCR结果表明在921bp处有特定条带(UL23-3×Flag基因)与此同时,Western blot实验也检测到pUL23蛋白。这些结果表明,成功构建重组慢病毒载体,包装成慢病毒感染后,病毒基因UL23能够在人胚肺成纤维细胞中诱导表达。Dox的最佳工作浓度为400ng/mL,最佳诱导时间为12h至24h之间。这将为进一步研究病毒蛋白pU23的功能奠定基础。     

家蚕核型多角体病毒同源重复区hr5的结构和功能

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)和首蓿尺蠖核型多角体病毒(AcMNPV)是宿主不同的同类昆虫杆状病毒.AcMNPV有5个同源重复区,hr5具较强增强子功能,最近被发现可能参与病毒DNA复制.Maeda等曾将BmNPV hrs图谱定位,最近又报道了BmNPV hr s的结构,但功能研究至今未见报道.与Maeda等同时,从野生型BmNPV基因组中克隆了hr 5区,进行了全序列测定,与Maeda等的报道有一定差别.功能分析证实,含BmNPV hr 5的质粒在辅助病毒存在下,不仅在宿主细胞(BmN)中能进行复制,而且在非宿主细胞 Sf 21中亦能进行复制.此外,不仅完整的BmNPV hr 5(含 8个重复单位),而且部分序列(含6个重复单位)亦显示上述功能.以上研究结果,并对hr 5在病毒 DNA复制过程中可能有的功能进行了探讨.     

miR-455-5p靶向SOCS3抑制RSV感染致气道上皮炎症反应的机制研究

摘要 目的：揭示miR-455-5p对呼吸道合胞病毒（RSV）感染致气道上皮细胞炎症反应的作用机制。方法：qRT-PCR检测30例健康体检儿童（健康组）、RSV感染轻症组（n=41）和重症组（n=31）患儿血清miR-455-5p水平。将16HBE细胞分为Control组、NC-agomir组、miR-455-5p-agomir组、NC-antagomir组、miR-455-5p-antagomir组。使用Lipofectamine 3000转染16HBE细胞后培养48 h后,分为Blank组、NC组（转染了NC-agomir的细胞）、RSV+NC-agomir组、RSV+miR-455-5p-agomir组,用RSV病毒液感染RSV+NC-agomir组和RSV+miR-455-5p-agomir组16HBE细胞,Blank组和NC组16HBE细胞正常培养。用CCK-8法和EdU法检测细胞增殖、TUNEL法检测细胞凋亡、ELISA法检测上清液中TNF-α、IL-6、IL-8水平,qRT-PCR检测miR-455-5p和SOCS3的mRNA水平,Western blot检测SOCS3、IFN-α、STAT1、STAT2、p-STAT1和p-STAT2的蛋白水平。结果：与健康组相比,轻症组和重症组患儿的血清miR-455-5p水平降低（P<0.05）。与轻症组相比,重症组的血清miR-455-5p水平降低（P<0.05）。与Control组和NC-agomir组相比,miR-455-5p-agomir组16HBE细胞的miR-455-5p水平、相对细胞活力和EdU阳性率升高（P<0.05）,TUNEL阳性率降低（P<0.05）,上清液中的TNF-α、IL-6和IL-8水平降低（P<0.05）,SOCS3 mRNA和蛋白水平降低（P<0.05）,IFN-α蛋白、STAT1和STAT2磷酸化水平升高（P<0.05）。与Control组和NC-antagomir组相比,miR-455-5p-antagomir组16HBE细胞的miR-455-5p水平、相对细胞活力和EdU阳性率降低（P<0.05）,TUNEL阳性率升高（P<0.05）,上清液中的TNF-α、IL-6和IL-8水平升高（P<0.05）,SOCS3 mRNA和蛋白水平升高（P<0.05）,IFN-α蛋白、STAT1和STAT2磷酸化水平降低（P<0.05）。与Blank组和NC组相比,RSV+NC-agomir组16HBE细胞的miR-455-5p水平、相对细胞活力和EdU阳性率降低（P<0.05）,TUNEL阳性率升高（P<0.05）,上清液中的TNF-α、IL-6和IL-8水平升高（P<0.05）,SOCS3 mRNA和蛋白水平升高（P<0.05）,IFN-α蛋白、STAT1和STAT2磷酸化水平降低（P<0.05）。与RSV+NC-agomir组相比,RSV+miR-455-5p-agomir组的miR-455-5p水平、相对细胞活力和EdU阳性率升高（P<0.05）,TUNEL阳性率降低（P<0.05）,上清液中的TNF-α、IL-6和IL-8水平降低（P<0.05）,SOCS3 mRNA和蛋白水平降低（P<0.05）,IFN-α蛋白、STAT1和STAT2磷酸化水平升高（P<0.05）。结论：miR-455-5p在RSV感染患儿血清中下调,上调miR-455-5p通过抑制SOCS3的转录和表达从而激活RSV感染的16HBE细胞中IFN-α介导的抗病毒反应。     

Nucleic acid binding activity of pns6 encoded by genome segment 6 of rice ragged stunt oryzavirus

Rice ragged stunt disease, caused by rice ragged stuntoryzavirus (RRSV), was first discovered in 1976–1977 inIndonesia and Philippines [1]. Subsequently the diseasewas found in most rice-growing countries in south-easternand far-eastern Asia [2] and may inflict heavy loss on thecrop. RRSV is the type species of the genus Oryzavirus in thefamily Reoviridae. The virus particle is icosahedral witha diameter of about 65–70 nm and the genome consistsof 10 double stranded RNA (dsRNA) segm…     

HIV/AIDS in Asia： The Shape of Epidemics and Their Molecular Epidemiology

The Asia-Pacific region is a home to 60% of the population in the world and to approximately one quarter of people with HIV/AIDS. Close to a million of people has been infected and a half million people died of AIDS annually in Asia,becoming the second largest epicenter of global AIDS epidemic. Molecular epidemiology has been useful tool to track a course of HIV spread. In-depth knowledge from the studies on molecular epidemiology elucidates the dynamics of HIV spread and the interrelationship of epidemics in the different regions in Asia.     

PNAS发表我科学家最新研究成果

由中国科学院昆明植物研究所植物化学与西部植物资源持续利用国家重点实验室、微生物研究所植物基因组学国家重点实验、中国疾病预防控制中心病毒病预防控研究所和云南省农业科学院生物技术研究所联合研究,首次发现双裂孕烷甾体glaucogenin C及其苷类化合物有选择性地抑制-正链RNA病毒,