富含半胱氨酸分泌蛋白生物学功能的研究进展

富含半胱氨酸分泌蛋白(cysteine-rich secretory proteins,CRISPs)包含众多不同起源的蛋白质,其大部分成员功能未知。近年来研究发现,哺乳动物中的CRISP家族各成员主要存在于生殖道中,在精子的成熟、精卵融合以及免疫系统中发挥着非常重要的作用,并且其表达水平的改变与人类多种重大疾病密切相关,有望成为某些疾病理想的生物标记物和药物靶点;而非哺乳动物中的CRISP家族成员则主要存在于腺体的分泌液中,能够阻断Na+、K+、Ca2+及环核苷酸门控通道,并与炎症反应密切相关。近来,作者所在实验室从低等无颌类脊椎动物七鳃鳗的口腔腺中分离纯化出富含半胱氨酸分泌蛋白,其与CRISP家族成员具有较高的同源性。该文针对CRISP家族成员生物学功能的最新进展做了分析归纳,并指出了相关研究的发展趋势。     

日本七鳃鳗胚胎发育及卵黄囊期仔鱼的异速生长

通过观察日本七鳃鳗Lampetra japonica (Martens, 1868)胚胎外部形态和内部组织结构变化, 描述受精卵从卵裂至器官形成以及仔鱼孵出的发育阶段, 采用实验生态学方法研究卵黄囊期仔鱼的异速生长模式。结果表明: 日本七鳃鳗卵子为乳白色, 呈卵圆形; 受精卵卵裂方式为全卵裂; 胚胎发育过程主要包括卵裂期、囊胚期、原肠胚期、神经胚期、头凸期、孵出前期和孵出期, 历时11—12d; 初孵仔鱼为乳白色, 全长约(3.41±0.24) mm, 体质量约为0.0006 g。日本七鳃鳗胚胎发育研究可为了解七鳃鳗胚胎发育过程, 早期脊椎动物的起源和发育进化研究提供参考。卵黄囊期内仔鱼身体各部分中, 头长和尾长均表现出快速生长, 同在7 日龄出现生长拐点, 且生长拐点后的生长速率都大于生长拐点前的生长速率; 而仔鱼体长在卵黄囊期内表现出慢速生长。在头部器官中, 吻长、鳃前长和鳃长均表现出快速生长现象, 吻长和鳃长分别在9日龄和8日龄出现生长拐点; 口笠长在3日龄时出现生长拐点, 在生长拐点前为等速生长, 而在生长拐点后表现出快速生长; 眼径和眼鳃间距则分别表现出等速生长和慢速生长。泄殖孔在卵黄囊期内未出现生长拐点, 生长速率相对于全长生长速率表现出快速生长现象。七鳃鳗卵黄囊期仔鱼的异速生长是在长期进化过程中, 适应早期生活环境和独特的生活方式而形成特有的发育机制。     

Phylogenetic analysis of 48 gene families revealing relationships between Hagfishes, Lampreys, and Gnathostomata

It has become clear that the extant vertebrates are divided into three major groups, that is, hagfishes, lampreys, and jawed vertebrates.Morphological and molecular studies, however, have resulted in conflicting views with regard m their interrelationships. To clarify the phylogenetic relationships between them, 48 orthologous protein-coding gene families were analyzed. Even as the analysis of 34 nuclear gene families supported the monophyly of cyclostomes, the analysis of 14 mitochondrial gene families suggested a closer relationship between lampreys and gnathostomes compared to hagfishes. Lampreys were sister group of gnathostomes. The results of this study sup-ported the eyclostomes. Choice of outgroup, tree-making methods, and software may affect the phylogenetic prediction, which may have caused much debate over the subject. Development of new methods for tackling such problems is still necessary.     

新型靶向药物研究的重要分子：可变淋巴细胞受体

自从2004年可变淋巴细胞受体（variable lymphocyte receptor, VLR）在七鳃鳗中首次发现以来,因VLR能识别多种抗原、具有简单的分子结构、物理化学性质稳定、对蛋白质以及聚糖的高亲和力和强特异性等多方面优点,学术界对于VLR的研究和改造十分火热。近年来,随着研究的不断深入,由VLR构建的重组分子广泛用于各领域的基础研究和应用研究。本文对近年来VLR面向下游的最新应用研究进行综述。在肿瘤研究中,VLR可特异性地精准识别碳水化合物,并能够区分只有1个官能团不同的多糖,可作为灵敏抗多糖试剂,用于识别肿瘤细胞上独特的糖复合物,为肿瘤的靶向治疗提供新的策略;VLR也可与其他经典的治疗方法进行结合。例如,将嵌合抗原受体进行改造,经过改造后可表达一种合成受体。这种合成受体可将T细胞的细胞靶向杀伤作用重新定位到所选择的靶点;VLR经重组改造后,也可用于改良分离纯化试剂或在水生生物疾病上发挥作用。这些新开发的VLR的作用有可能作为新型的识别、诊断和治疗试剂。本文将从VLR多样性产生的机制、VLR与糖生物学和生物医药研究上的关系、VLR用于改良分离纯化试剂的作用、VLR在水生生物疾病研究等方面进行阐述,以期为VLR用于疾病药物研发等相关应用提供参考。     

寻找胸腺

发现圆口纲的脊椎动物,像盲鳗和七鳃鳗都具有获得性免疫系统,尽管它们没有像免疫球蛋白和MHC,却拥有两种分别类似T细胞和B细胞的免疫细胞。现在,德国弗莱堡马普学会的Thomas Boehm和同事们认为他们已经找到了圆口动物获得性免疫系统的又一个重要组成部分：七鳃鳗胸腺。     

日本七鳃鳗(Lampetra japonica)口腔腺表达序列标签(EST)分析

以日本七鳃鳗口腔腺为材料,构建库容量为2.1×106pfu/mL的cDNA文库。通过对文库中克隆子的序列测定和生物信息学初步分析,得到1323条有效EST序列。经BlastX及BlastN软件进行同源对比分析,653条(49.36%)EST可在蛋白质或核苷酸水平上找到同源序列,其中328条与七鳃鳗科物种同源。同源序列功能分类大致分为11类,与蛋白质合成有关的蛋白所占比例最大。1323条EST进行片段重叠群分析(contig analysis)获得包括547条序列在内的162组片段重叠群并确定了8条全长cDNA。日本七鳃鳗口腔腺cDNA文库以及EST文库的成功构建,为研究日本七鳃鳗口腔腺的功能基因和蛋白质组学奠定了基础。     

重组七鳃鳗富含半胱氨酸RGD蛋白rLj-RGD1对人肝癌HepG2细胞的抑制作用

rLj-RGD1为源于日本七鳃鳗口腔腺的基因重组蛋白,其富含半胱氨酸并具有一个RGD(Arg-Gly-Asp)模体.前期工作表明,rLj-RGD1具有抑制血小板聚集及血管新生的RGD毒素蛋白典型功能.为了研究rLj RGD1是否具有RGD毒素蛋白的另一典型抗肿瘤功能,以人肝癌HepG2细胞为模型,对rLj RGD1进行了活性研究.MTT法结果显示,rLj-RGD1呈剂量依赖方式抑制HepG2细胞的增殖,其半抑制浓度(IC50)为36 μmol/L;细胞迁移与浸润实验结果显示,rLj-RGD1能以剂量依赖方式抑制HepG2细胞碱性成纤维生长因子（bFGF）诱导的迁移与浸润.Hoechst染色和DNA Ladder等细胞凋亡实验表明,rLj-RGD1能够以剂量依赖方式诱导HepG2细胞发生凋亡.细胞黏附实验表明,rLj-RGD1以剂量依赖方式抑制HepG2细胞与玻连蛋白(vitronectin, VN)的黏附.上述结果表明,rLj-RGD1具有抑制人肝癌HepG2细胞增殖、迁移和浸润的功能,并可诱导其发生失巢凋亡. 本研究结果提示,rLj-RGD1具有典型的RGD毒素蛋白抗肿瘤功能,其未来具有成为抗肿瘤药物的潜力.     

七鳃鳗g型溶菌酶的分子特征和抗菌活性

溶菌酶是先天免疫系统中对抗细菌病原体感染的一种关键蛋白．本研究从七鳃鳗中克隆g型溶菌酶基因. 其酶基因cDNA为701 bp（GenBank 序列号KP204854）,开放阅读框为555 bp,编码由184个氨基酸组成的多肽,理论分子质量为20.24 kD,等电点为5.48,含有1个半胱氨酸残基,无信号肽．实时荧光定量PCR分析表明,七鳃鳗g型溶菌酶基因在各组织中广泛表达,其中在肠中表达量最高．脂多糖（LPS）体内刺激七鳃鳗后发现,溶菌酶在口腔腺和头肾表达量显著升高．以溶壁微球菌和哈维弧菌为底物检测重组g型溶菌酶的活性时,均表现出抗菌活性,最适pH为7.5,最适温度为35℃．扫描电镜分析表明,重组酶能够使溶壁微球菌破裂．以上结果均表明,g型溶菌酶在七鳃鳗的先天免疫系统防御病菌感染中起到重要作用．     

东北七鳃鳗肠道应答气单胞菌免疫刺激相关蛋白的鉴定

动物肠道中寄生的微生物与宿主的营养、免疫及防御功能密切相关。本研究在东北七鳃鳗肠道中分离获得一株优势细菌,并鉴定为气单胞菌属（Aeromonads sp.）。建立了荧光定量PCR快速检测气单胞菌拷贝数的方法,经poly(I∶C)刺激后,气单胞菌数量下降115倍。因此,该肠道气单胞菌被认为是七鳃鳗肠道适应性免疫系统进化的关键菌群之一。为了进一步分析气单胞菌对东北七鳃鳗肠道适应性免疫影响的分子机制,将分离菌株腹腔注射七鳃鳗,利用双向电泳技术鉴定了七鳃鳗肠道应答气单胞菌免疫刺激的相关蛋白。共鉴定19个差异表达蛋白质,其中12个蛋白质表达上调,5个蛋白质表达下调,1个蛋白质刺激后消失,1个新增蛋白质,并对蛋白质功能进行分类。七鳃鳗肠道应答气单胞菌免疫刺激的差异表达蛋白分别参与了七鳃鳗适应性免疫调控、信号转导及能量代谢等。该研究可拓宽对七鳃鳗免疫研究的途径,为深入探讨适应性免疫系统发育提供理论基础和新的研究思路。     

日本七鳃鳗(Lampetra japonica)肝脏ESTs 分析与比较转录组研究

以日本七鳃鳗(Lampetra japonica)肝脏为材料构建cDNA文库, 在文库中随机挑选克隆子进行测序共得到10077条有效ESTs(expressed sequence tags)序列. ESTs序列分析显示, 8515条ESTs拼成648条片段重叠群, 共得到2210条转录本, 其中47.06%的转录本预测为全长序列; 利用BLAST程序在GenBank数据库中进行同源性搜索发现2053条转录本有同源序列匹配, 占总转录本的92.9%. 更进一步对这些基因产物进行Gene Ontology注释, 结果发现, 在日本七鳃鳗肝脏中与有颌类免疫、凝血和代谢相关的基因大量表达, 并预测了8个新基因. 通过对日本七鳃鳗与底鳉(Fundulus heteroclitus)、鼠(Mus musculus)、牛(Bos taurus)和人(Homo sapiens)肝脏转录组的比较分析, 发现日本七鳃鳗肝脏中比其他物种优势表达的是甲壳质酶和多糖代谢等相关的基因, 这些基因可能在日本七鳃鳗免疫中发挥重要作用. 此外, 也利用TargetScan软件对日本七鳃鳗肝脏转录组中3′UTR区进行microRNA靶标识别, 结果发现了与人类癌症基因调控同源的microRNA靶标, 这为研究人类癌症提供了有益的线索. 上述结果将为七鳃鳗功能基因和蛋白组学的研究以及脊椎动物的基因组进化提供重要的理论基础.