瑞氏七鳃鳗乳酸脱氢酶（LDH）同工酶凝胶电泳分析

本文用聚丙烯酰胺凝胶电泳方法,对瑞氏七鳃鳗五种不同组织（骨骼肌、心、肾、肠、鳃）中ＬＤＨ同工酶进行了分析研究,结果表明,ＬＤＨ同工酶具有组织特异性,其中骨骼肌中含有五种ＬＤＨ同。酶,即ＬＤＨ１、ＬＤＨ２、ＬＤＨ３、ＬＤＨ４、ＬＤＨ５,鳃含有ＬＤＨ１和ＬＤＨ４而肾和心只含有ＬＤＨ１,肠只含有ＬＤＨ４。     

日本七鳃鳗富含半胱氨酸RGD蛋白Lj-RGD1抑制血小板聚集及抗血管新生功能

Lj-RGD1来源于日本七鳃鳗口腔腺,富含半胱氨酸并具有RGD(Arg-Gly-Asp)模体.为了验证Lj-RGD1是否具有抑制血小板聚集、抗血管新生等去整合素样典型功能,本文对七鳃鳗Lj-RGD1进行了克隆表达及活性测定.提取七鳃鳗口腔腺中总RNA进行RT-PCR扩增,获得Lj-RGD1的420 bp cDNA.对其进行克隆、表达及组氨酸亲和层析纯化后,获得分子量为169 kD的可溶性蛋白rLj-RGD1.活性测定结果显示,rLj-RGD1呈剂量依赖方式抑制ADP诱导的兔血小板聚集,IC50为123 μmol/L;血管新生抑制实验结果表明,rLj-RGD1能够诱导ECV304细胞凋亡,抑制ECV304细胞增殖和管状物形成,并呈剂量依赖性方式抑制鸡胚胎绒毛尿囊膜（chorioallantoic membrane,CAM）血管新生.由此可见,Lj-RGD1具有去整合素样生物活性,在血栓或血管异常新生类疾病治疗中具有应用前景.     

七鳃鳗myd88基因的生物学特性及其下游分子的表达模式分析

髓样分化因子88 (Myeloid differentiation factor 88, MYD88)是Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)信号通路的关键接头分子, 在先天性免疫和适应性免疫中都起到重要作用。为了揭示七鳃鳗Myd88的生物学功能, 研究首次从七鳃鳗(Lampetra japonica)中克隆了myd88基因, 其ORF为852 bp, 共编码283个氨基酸, 推测的分子量为32.432 kD, 等电点为6.25, 无信号肽。多重序列比对表明七鳃鳗Myd88的氨基酸序列与其他物种同源性较高, 具有高度保守的N端死亡结构域和C端的TIR结构域的Box1、Box2和Box3基序。实时荧光定量PCR分析表明: myd88基因在七鳃鳗各组织中均有低水平转录表达, 鳃中表达量最高, 其次是肌肉、髓和肾。脂多糖(LPS)体内刺激七鳃鳗后, 七鳃鳗myd88在白细胞中表达量升高最显著, 其次是在鳃中的表达量也明显升高, 表明七鳃鳗Myd88参与七鳃鳗的抗菌免疫过程。此外, LPS刺激七鳃鳗还能诱导TLR信号通路Myd88依赖途径的下游信号分子Irak1、Traf6、Ikkβ和Nfkb在各组织中的转录表达。研究结果表明七鳃鳗中可能存在TLR/Myd88信号通路, 为进一步探究该信号通路参与免疫应答的起源与进化奠定了基础。     

东北七鳃鳗早期发育研究

通过开展东北七鳃鳗(Lampetra morii)胚胎、卵黄囊期仔鱼和幼鱼发育研究, 系统地描述东北七鳃鳗的早期发育形态特征和生长发育规律。研究结果表明: 东北七鳃鳗的卵裂为全裂类型, 在(18±1)℃水温下, 受精卵经卵裂期、囊胚期、原肠胚期、神经胚期、头凸期、孵出前期以及孵出期, 历时11—12d孵育出仔鱼。初孵仔鱼体重为(0.00032±0.00002) g, 全长为(0.29±0.02) cm。在卵黄囊期内, 仔鱼体重和全长随日龄的增加而增长, 吻长、眼径、眼鳃间距、口笠长、鳃前长、鳃长、头长、体长、尾长和泄殖孔长均存在异速生长现象。初孵仔鱼经过约15d(卵黄囊期)发育成幼鱼, 幼鱼卵黄囊完全吸收, 消化道贯通, 形成肠道, 开始摄食。在幼鱼期, 经5 个月的培育, 幼鱼体重和全长随月龄的增加而增长, 体色逐渐加深, 5月龄幼鱼的体重和全长分别为(0.07±0.01) g和(3.87±0.32) cm。东北七鳃鳗的早期发育研究为七鳃鳗发育生物学积累基础资料, 同时也为七鳃鳗的人工增养殖提供了科学依据, 推进七鳃鳗的模式化进程。     

七鳃鳗Lja-SHP2分子鉴定、重组表达及免疫学研究

高等脊椎动物的蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2(SH2 domain-containing protein-tyrosine phosphatase-2)由ptpn11基因编码,催化酪氨酸残基去磷酸化,与其他能催化酪氨酸磷酸化的蛋白酪氨酸激酶共同调节机体内多种信号通路的信号传导。以往研究表明,SHP2在高等脊椎动物T细胞和B细胞的激活与信号转导过程中起着重要作用。为了研究无颌类脊椎动物日本七鳃鳗(Lampetra japonica)中与SHP2同源的分子——Lja-SHP2在免疫应答反应中的作用,本研究通过PCR扩增获取其Lja-SHP2开放阅读框序列,并构建到原核表达载体pET-32a中,成功在大肠杆菌中实现重组蛋白表达并制备了其兔源多克隆抗体。用混合菌免疫刺激日本七鳃鳗后,通过实时荧光定量PCR和免疫印迹方法检测了Lja-SHP2在日本七鳃鳗免疫相关组织中mRNA和蛋白水平表达谱。结果显示,混合菌免疫刺激后,Lja-SHP2 mRNA和蛋白表达在外周血白细胞和髓样小体中无显著变化,而在鳃组织中显著性上调(P<0.05),说明Lja-SHP2在混合菌刺激后主要参与了鳃组织的免疫应答反应。为了进一步探究Lja-SHP2与淋巴细胞亚群免疫应答反应的相关性,本研究分别使用B细胞有丝分裂原脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)和T细胞的有丝分裂原植物凝集素(phytohemagglutinin,PHA)免疫刺激日本七鳃鳗。经LPS免疫刺激后,与对照组相比,白细胞中Lja-SHP2蛋白表达显著上调,鳃组织和髓样小体没有显著性差异表达;但经PHA免疫刺激后,与对照组相比,白细胞、鳃组织和髓样小体3种组织中Lja-SHP2均有上调,尤其在白细胞中上调最为显著,大约是对照组的2.5倍,说明Lja-SHP2参与了日本七鳃鳗由PHA介导的免疫应答反应。由于PHA能刺激日本七鳃鳗鳃组织中VLRA+淋巴细胞的活化,这表明Lja-SHP2可能参与了PHA介导的VLRA+淋巴细胞亚群的免疫应答反应。上述研究结果为进一步探索Lja-SHP2在七鳃鳗免疫应答过程中的功能奠定了基础,也为揭示SHP2分子家族的系统发生及探索高等脊椎动物适应性免疫系统的早期发生及其进化历程提供一定的线索。     

日本七鳃鳗钙调蛋白分子克隆、组织定位及功能分析北大核心CSCD

钙调蛋白(calmodulin,CaM)是高度保守的钙离子结合蛋白质,可形成Ca2+-CaM复合体,从而调节细胞代谢以及靶酶的功能。日本七鳃鳗(Lampetra japonica)作为原始的无颌类脊椎动物,对研究脊椎动物分子起源进化及器官发育分化具有重要的研究价值。通过提取日本七鳃鳗髓组织总RNA,利用RT-PCR方法获得日本七鳃鳗CaM(简称Lj-CaM)基因并进行生物信息学分析。将LjCaM基因分别构建到原核表达载体p ColdⅠ和真核表达载体p EGFP-N1中,利用亲和层析技术纯化得到Lj-CaM蛋白。圆二色谱分析结果表明,Lj-CaM属于典型的α-螺旋结构型蛋白质。免疫印迹和免疫组化结果表明,CaM主要存在于日本七鳃鳗的肠、鳃、髓、肾组织中,在心和肝组织中几乎不表达。细胞免疫荧光结果显示,CaM定位于细胞核中。q PCR和免疫印迹方法检测发现,当293T细胞中Lj-CaM过表达时,对下游靶基因CaMKⅡ作用不明显,但促进PLA2G2A表达。本研究报道了日本七鳃鳗CaM结构、细胞组织定位分布以及基因调控研究,对其结构、分子起源与进化、分子调控及功能方面的研究奠定了基础。     

七鳃鳗p38α和β参与LPS介导的VLRB类淋巴细胞亚群的免疫应答反应

p38MAPK是丝裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinases,MAPK）家族的一个亚类,在高等脊椎动物免疫应答的信号转导过程中扮演着非常重要的角色。在日本七鳃鳗（Lampetra japonica）中发现,p38MAPK以两种异构体的形式存在。通过克隆它们的开放阅读框并进行同源序列比对和系统发育分析,鉴定它们分别为p38α（Lja-mapk14）和p38β（Lja-mapk11）。用混合菌刺激七鳃鳗,利用免疫印迹方法,检测Lja-mapk14在外周血类淋巴细胞、鳃组织和髓样小体中,分别在加强免疫36 h、24 h和24 h后,表达量达到峰值,分别为对照组的2.9、2.1和2.6倍;而Lja-mapk11在以上组织中,都在加强免疫36 h后达到表达量峰值,分别为对照组的2.2、2.5和6.3倍。实时荧光定量PCR检测发现,Lja-mapk14的mRNA表达水平在混合菌加强免疫36 h后,分别在类淋巴细胞、鳃组织和髓样小体中,上调2.3、1.5和3.4倍;而Lja-mapk11的则分别在类淋巴细胞、鳃组织和心肌中,上调1.3、2.6和1.6倍。以上结果在mRNA和蛋白质水平证明,Lja-mapk14和Lja-mapk11均参与七鳃鳗的免疫应答反应。采用B细胞和T细胞丝裂原LPS和PHA分别对七鳃鳗进行刺激,免疫印迹结果显示,Lja-mapk14和Lja-mapk11蛋白质表达量经LPS加强免疫36 h后,在类淋巴细胞、鳃组织和髓样小体中,上调表达1.3 ～ 4.1倍;而经PHA加强免疫36 h后,Lja-mapk14和Lja-mapk11在上述组织中表达量均不存在显著变化。以上结果说明,Lja-mapk14和Lja-mapk11可能参与了B细胞丝裂原LPS介导的VLRB类淋巴细胞亚群的免疫应答反应。     

运动过程的网络逻辑——从离子通道到动物行为

为了揭示神经网络在脊椎动物运动中所行使的内在功能,作者开发了七鳃鳗这种低等脊椎动物模型。在这套系统中,不仅可以了解到运动模式生成网络以及激活此网络的命令系统,同时还可以在运动中研究方向控制系统和变向控制系统。七鳃鳗的神经系统有较少的神经元,而且运动行为中的不同运动模式可以由分离的神经系统所引发。模式生成神经网络包括同侧的谷氨酸能中间神经元和对侧的抑制性甘氨酸能中间神经元。网络中的突触连接、细胞膜特性和神经递质都也已经被鉴定。运动是由脑干区域的网状脊髓神经元所引起,而这些神经元又是被问脑和中脑分离的一些运动命令神经元群所控制。因此,运动行为最初是由这两个“运动核心”所启动。而这两个运动核心被基底神经节调控,基底神经节即时地做出判断是否允许下游的运动程序启动。在静止情况下基底神经节的输出核团维持对下游不同运动核心的抑制作用,反之则去除抑制活化运动核心。纹状体和苍白球被认为是这个运动抉择系统的主要部件。根据“霍奇金一贺胥黎”模型神经元开发了这套网络模型,不同的细胞具有各自相应的不同亚型的钠、钾、钙离子通道和钙依赖的钾通道。每个模型神经元拥有86个不同区域模块以及其对应的生物学功能,例如频率控制、超极化等等。然后根据已有实验证据,利用突触将不同的模型神经元相连。而系统中的10000个神经元大致和生物学网络上的细胞数量相当。突触数量为760000。突触类型有AMPA、NMDA、glycine型。有了这样大规模的模型,不仅可以模拟肌节与肌节之间的神经网络,还可以模拟到由基底神经节开始的行为起始部分。此外,这些网络模拟还被用于一个神经机械学模型来模拟包含有推进和方向控制部分的真实运动。     

七鳃鳗胆道闭锁过程中胆汁酸耐受机制研究进展

胆道闭锁(biliary atresia,BA)是一种罕见的婴幼儿肝胆疾病,其特征是纤维硬化性胆管病变,导致肝外胆管和肝内胆管阻塞或闭塞,胆汁不能向肠道排泄,胆汁酸对肝实质细胞造成严重损伤,最后导致肝硬化和肝衰竭危及生命.目前,胆道闭锁的发病机理尚不明确,临床上普遍采用"先葛西"、"后移植"的序贯性治疗方式.葛西手术(...