改良异硫氰酸胍一步法提取红豆杉细胞RNA

将Chomczynski建立的RNA一步分离法加以适当改进,用以提取红豆杉细胞株E2、TC、H21的总RNA,所获RNA样品的A260/A280比值分别是1.82±0.03、1.85±0.04、1.74±0.03;A260/A230比值分别为2.02±0.03、2.15±0.03、2.03±0.05;得率分别为51.36±0.05μg/g、52.40±0.04μg/g、51.08±0.06μg/g新鲜细胞.变性琼指糖凝胶电泳图谱显示每一样品均具有完好的28S和18S两条亮带.     

一步法纯化青霉素G酰化酶

本文报导了用水平等电聚焦电泳技术由粗酶液一步纯化制得纯青霉素G酰化酶.     

一步法产1,3-丙二醇酿酒酵母基因工程菌的构建

1,3-丙二醇(1,3-PD)是一种重要的化工原料,发酵法生产1,3-PD是一条新颖且具有潜在竞争力的生产途径。本研究在前期工作的基础上,将分别来源于大肠杆菌和肺炎克雷伯氏菌的基因片段yqhD和dhaB串联表达,构建重组表达载体pYX212-zeocin-pGAP-yqhD-pGAP-dhaB;并得到重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)W303-1A/pYX212-zeocin-pGAP-yqhD-pGAP-dhaB。该重组菌和对照S.cerevisiae分别以葡萄糖为底物摇瓶发酵72h后,重组酿酒酵母发酵液中1,3-PD含量约为1.5g/L;而对照菌株不产1,3-PD。以上结果表明本研究在国内首次成功构建了直接以葡萄糖为底物发酵生产1,3-PD的酿酒酵母基因工程菌。为进一步将dhaB、yqhD基因导入其他以葡萄糖为底物高产甘油的酵母宿主中表达,获得以葡萄糖为底物一步法发酵高产1,3-丙二醇工程菌打下了坚实的基础。     

Sepharose 4B一步法对金环蛇蛇毒磷脂酶A2的分离纯化

利用经酸处理的Sepharose 4B为层析介质,以含0.2mol/L半乳糖,pH7.4台氏液作为洗脱液,从广西产金环蛇(Bungarus fasciatus)蛇毒中一步分离得到一种磷脂酶A2.用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其分子量为14 kDa.N端部分序列测定表明,所分离得到的磷脂酶A2其N端16个氨基酸残基序列与已报道的金环蛇蛇毒磷脂酶A2同功酶Ⅵ(Lu & Lo,1978)一致.该酶糖含量较高,为13.4%;具有弱的磷脂酶A2活性,无毒,也无溶血和出血毒活性.     

H9与H5亚型禽流感病毒血凝素基因的快速鉴别

建立一步法RT-PCR检测方法,对禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)的血凝素(Hemagglutinin,HA)分型进行了研究.参照AIV的HA基因序列设计1对引物,对H9和H5亚型AIV进行了扩增,产物大小分别为579bp和177bp.经测试,该引物不与新城疫病毒等鸡的其它传染性病原及鸡肌肉组织的核酸发生交叉反应.敏感性分析发现,从50pg的AIV总RNA中亦能扩增到目的条带.结果表明,此次利用1对引物建立的一步法RT-PCR方法简便适用,可以在一次反应中同时将H9和H5亚型AIV进行快速检测和分型.另外,两个亚型的扩增产物均包含了HA裂解位点在内的基因序列,可通过测序推导氨基酸顺序以预测H5或H9亚型禽流感病毒的潜在毒力.     

一步法双重RT-PCR检测SARS冠状病毒技术研究

参照WHO公布的PCR检测SARS相关冠状病毒的引物序列,我们合成了4对引物,建立了一步法RT-PCR检测SARS相关冠状病毒的方法.利用该方法,对武汉市非典型肺炎疑似病例喉漱液进行了SARS相关冠状病毒检测,其中w20用4对引物检测均在相应的位置出现了DNA条带,W1只有BNIin-s/as引物出现预期产物.同时我们将样品W20的RT-PCR扩增产物进行了序列测定,结果显示该片段序列与其他地区和国家分离的SARS冠状病毒基因高度同源性,这进一步说明RT-PCR扩增的产物是SARS冠状病毒基因片段.在此基础上我们又建立了四种SARS冠状病毒一步法双重RT-PCR检测方法,在一个RT-PCR反应中用两套引物同时对SARS冠状病毒基因两个不同的片段进行检测,检测结果具有更高的特异性.     

MNP-SH复合物一步法快速分离和纯化mRNA的新方法

本文建立了一种快速分离和纯化mRNA的新方法.为避免RT-PCR实验中mRNA降解问题,我们使用磁性纳米粒子,快速儋有效的从培养的细胞、组织以及脐带血中分离出带有ploy(A) 结尾的mRNA用于实验.研究结果表明,磁性纳米粒子经过修饰连接Oligo(dT)16可直接分离mRNA,其方法操作简单,快捷、省时,可有效地用于基因表达的研究.     

流式微球一步法快速免疫检测马铃薯A病毒

[目的]建立流式微球一步法快速免疫检测马铃薯A病毒(PVA)的新方法.[方法]以荧光微球为反应载体,通过在微球表面进行双抗夹心免疫反应形成微球-捕获抗体-PVA-标记FITC检测抗体的复合物,利用流式细胞仪荧光检测系统收集荧光信号.[结果]通过实验优化检测条件,最佳捕获抗体工作浓度为4μg/mL、最佳检测抗体工作浓度为1:25倍稀释、最佳反应时间为2h;与马铃薯Y病毒、莴苣花叶病毒、番茄环斑病毒等均未出现交叉反应;阳性样品经64倍稀释后依然可检出,检测灵敏度是传统微孔板ELISA的4倍.[结论]流式微球一步法能灵敏、快速、简便的检测马铃薯A病毒.     

新疆伊犁地区驴脑组织亨德拉病毒感染情况调查

目的调查新疆伊犁地区草原放养驴群中亨德拉病毒(Hendra virus,HeV)中枢感染的流行情况。方法采用一步法实时荧光定量RT-PCR检测病毒核酸片段的方法对采自新疆伊犁地区草原放养、未接种HeV疫苗的65例驴脑组织进行HeV核蛋白(N)基因片段检测。结果65例驴脑组织成功进行一步法实时荧光定量RT-PCR检测,未检出阳性样本。结论目前尚未发现我国新疆伊犁地区放养驴中存在HeV中枢神经感染的证据,提示该地区出现HeV感染流行的可能性不大。