mRNA差异显示技术中特异条带回收方法的比较

目的：建立简化的mRNA差异显示技术中特异条带的回收方法。方法：用单个小鼠早期发育的胚胎构建mRNA差异显示技术,用一步法和煮沸法分别从银染的聚丙烯酰胺凝胶中回收差异显示的特异条带,并进行再扩增、回收、克隆及酶切鉴定。结果：两种不同的回收方法经过mRNA差异显示技术程序环节,证明其具有相同的实验效果。结论：应用简化的一步法和煮沸法对单胚构建的mRNA差异显示技术中的特异条带进行回收,具有有效性和可靠性。     

谷氨酸棒杆菌一步法发酵糖质原料生产γ-聚谷氨酸

γ-聚谷氨酸在食品、化妆品、生物医药等领域具有广泛的应用,目前主要的生产菌株是谷氨酸依赖型菌株,在生产过程中需要添加谷氨酸作为前体,因而生产γ-聚谷氨酸的成本较高。文中主要研究从糖质原料一步法发酵合成γ-聚谷氨酸的生产工艺。首先,从产γ-聚谷氨酸的菌株枯草芽孢杆菌中克隆γ-聚谷氨酸合成酶的基因簇pgs BCA,在谷氨酸棒杆菌模式菌株ATCC13032中进行诱导型和组成型表达,结果显示,仅诱导型表达菌株可以积累γ-聚谷氨酸,产量为1.43 g/L。进一步对诱导条件进行优化,确定诱导时间为2 h,IPTG浓度为0.8 mmol/L,γ-聚谷氨酸产量为1.98g/L。在此基础上,在一株高产谷氨酸的谷氨酸棒杆菌F343中外源表达pgs BCA,对重组菌进行发酵,结果表明,在摇瓶发酵中γ-聚谷氨酸产量达到10.23g/L,在5L发酵罐中产量达到20.08g/L;继而对γ-聚谷氨酸进行分子量测定,结果显示,产自F343重组菌的γ-聚谷氨酸的重均分子量比产自枯草芽孢杆菌的提高34.77%。文中构建了一步法发酵糖质原料生产γ-聚谷氨酸的新途径,同时为开发其潜在应用奠定了基础。     

双重荧光定量一步RT-PCR法同时检测GⅠ、GⅡ型诺如病毒

建立一种可同时检测诺如病毒GⅠ和GⅡ型的双重荧光定量一步法RT-PCR方法。应用针对GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的特异性引物以及Taqman探针,优化反应体系及条件,建立双重荧光定量一步法RT-PCR方法。对该方法的灵敏度、特异性、重复性进行评估,并对粪便标本进行检测,以传统RT-PCR方法作为参考评价此方法。结果表明,该方法特异性强,与肠道腺病毒、轮状病毒、星状病毒均无交叉反应,对GⅠ和GⅡ型诺如病毒核酸的最低检出限分别可达103拷贝/μL,具有很好的重复性。对100份粪便标本进行检测,诺如病毒的阳性率为31%,其中GⅠ型为3%,GⅡ型为28%,而传统RT-PCR法的检出率为22%。本文建立的双重荧光定量一步RT-PCR法能同时对GI和GII型诺如病毒进行快速检测,其灵敏度高、特异性好,可应用于胃肠炎病人中检测诺如病毒。     

非洲菊花瓣RNA提取方法的改进

利用异硫氰酸胍一步法和植物总RNA提取试剂盒（RNeasy Plant Mini Kit）提取非洲菊（Gerbera hybrida）花瓣中总RNA时存在多糖的干扰。实验中利用异硫氰酸胍一步叶提取总RNA,在RNA沉淀后,再次加入适量变性液,冻融2次,再加热至45℃使RNA完全溶解;试剂盒提取时,适当延长各提取步骤的离心时间,并增加DEPC H2O溶解RNA的时间。通过以上操作方法的改进可排除多糖的干扰,得到高质量的总RNA。为进一步利用Northern杂交技术研究非洲菊中花色素苷基因的表达,进行花色改良提供了方便、有效的实验手段。     

Hendra病毒一步法Real-time RT-PCR检测方法的建立

目的 建立针对Hendra病毒N基因的一步法Real-time RT-PCR检测方法,用于Hendra病毒感染样本的快速检测和准确定量.方法 针对Hendra病毒的保守基因N设计引物和探针,构建体外转录的RNA片段作为标准品,建立一步法Real-time RT-PCR反应方法并分析敏感性和特异性.结果 所设计的引物经Blast检索可以用于检测所有已知的Hendra病毒株.本研究建立的一步法Real-time RT-PCR方法可以特异性检测出Hendra病毒,不与Nipah病毒产生交叉反应.检测灵敏度为2.6×100～2.6×101copies/μl.标准曲线的线性范围为2.6×101～2.6×107copies/μl.结论 本研究建立的一步法Real-time RT-PCR方法敏感性和特异性较高,且不易出现污染引起的假阳性结果,适合用于Hendra病毒感染样本的检测.     

一步法发酵菊芋产乙醇菌种的筛选及产酶条件、酶学性质的研究

从腐烂的菊芋及实验室保存的菌种中,选育到一株发酵菊芋产乙醇的菌株克鲁维酵母Kluyveromyces marxianus Y1。利用正交实验法对克鲁维酵母产菊粉酶的培养基组成及培养条件进行优化,确定培养基组成（g/L）为：菊粉40,酵母粉4,蛋白胨4,尿素1;初始pH5．0,温度30℃,150r／min条件下培养达到最佳产酶效果（57U／mL）。该菌株所产菊粉酶的性质测定结果表明：以菊粉为底物,该菊粉酶最适反应温度为55℃,在60℃以下稳定性很好,高于60℃时酶迅速失活;最适pH为5．0,pH4．6—5．2范围内酶稳定性很好;该酶属于外切型菊粉酶,体积分数为8％的乙醇对酶活力基本没有影响。     

禽Ⅰ型副粘病毒f基因克隆及序列分析

用RT—PCR一步法对云南省不同禽类(鸡、鸽子)3株禽Ⅰ型副粘病毒F基因进行扩增和克隆,并对其f基因片段核苷酸序列进行分析,结果表明,云南省禽Ⅰ型副粘病毒各毒株同源性为88．1％--94．9％,与疫苗株LaSota和强毒株F48E9的同源性为85．6％。所分离两株新城疫病毒在F蛋白裂解位点区(112—117aa)的氨基酸序列与强毒株在这一区域的序列完全相同,表明为强毒株。鸽Ⅰ型副粘病毒F蛋白裂解位点区的氨基酸序列与PPMVZQ98—1株在这一区域的序列完全相同,揭示为中强毒株。以1662bp核苷酸绘制系统发育树,表明云南地方新城疫病毒届于基因Ⅶ型,鸽Ⅰ型副粘病毒届于基因Ⅵ型。     

EnVision与特异性抗体的一步法免疫组织化学标记

探讨En Vision与特异性抗体复合一步法免疫组织化学标记的可行性及其应用效果。筛选适合于该法的特异性抗体。利用辣根过氧化物酶标记的第二抗体（En Vision）分别与72种单克隆和多克隆特异性抗体混合配制成即用型试剂,将两步标记法变为快速微波一步法,并对2100余例各种良性和亚性肿瘤的免疫组化标记结果进行观察和分析。结果显示绝大发特异性抗体的特异性和敏感性与标准En Vision法相似,其中46种特异性抗体结果稳定,重复性佳;14种特异必抗体稳定性欠佳,但临用前新配制效果仍较理想;12种不理想,不主张用于此法,结果表明En Vision与特异性抗体复合免疫组化一步法是一种有效、快速、简便的免疫组化染色技术。适用于临床病理快速免疫组化诊断,但对所用的特异性抗体应注意选择。     

英国梧桐离体无性繁殖体系的建立

报道了以英国梧桐[Platanus acerifolia（Ait．）Willd]变异株的种子为材料建立的植株再生体系。研究结果表明：用70％酒精处理40s,0．1％升汞处理40min,在不影响种子萌发率的前提下可将污染率降到最低;MS＋6．BA6～7mg／L＋NAA0．2—0．3mg／L为子叶诱导愈伤组织和分化幼芽的最适培养基,MS＋6-BA0．3mg／L＋NAA0．01mg／L为丛芽扩繁的最适培养基;培养基中添加适量的GA,对丛芽的生长具有显著的促进作用;蔗糖和大量元素的浓度分别为2．5％和2／3MS是解决幼苗玻璃化的最适量;幼苗生根的最适培养基为1／2MS＋NAA0．5mg／L＋6-BA0．1mg／L;无菌种苗的叶片在MS＋6-BA1．5—2．0mg／L＋KT0．5mg／L＋IBA0．5mg／L的培养基上可直接再生植株,建立了一步法无菌叶片再生体系。为悬铃木遗传操作和基因转化奠定了良好基础,也为其他植物尤其是优良树木的遗传改良提供了参考。