基于BAC重组酶系统构建莱航鸡多位点基因打靶载体的研究

以莱航鸡重复的rDNA基因间的间隔序列为靶位点,利用BAC重组酶系统构建含人干扰素基因的多位点基因打靶载体,为建立莱航鸡多位点基因打靶技术获得关键材料。首先构建BAC-TDN筛选载体,然后构建pYLVS-GID表达载体。将BAC-TDN筛选载体和pYLVS-GID表达载体共转化至大肠杆菌NS3529中,通过其Cre重组酶的作用形成BAC-TDN-VS-GID质粒,采用归位内切酶I-SceⅠ切除pYLVS质粒骨架,利用接头LS使之环化,构建成莱航鸡大容量多位点基因打靶载体BAC-TDN-GID。每次克隆均经酶切或PCR、测序等鉴定DNA片段的插入及插入方向。以该载体为材料的多位点基因打靶技术将提高基因定点整合效率,解决外源基因不能稳定表达、安全性等部分问题,突破了DNA重复序列不能作为外源基因整合靶位点的禁区。     

马里苷、黄诺玛苷对db/db小鼠肠道菌群的影响及相关性

目的探索两色金鸡菊中黄酮类成分马里苷、黄诺玛苷对db/db小鼠肠道菌群的影响。方法将db/m小鼠作为正常对照组,db/db小鼠分为db/db模型组、db/db+恩格列净(db/db+Empagliflozin)组、db/db+马里苷(db/db+Marein)组、db/db+黄诺玛苷(db/db+Flavanomarein)组,每组8只。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)的方法检测小鼠粪样中Bacteroides ovatus、Ruminococcus gnavus的变化,并运用Pearson检验分析Bacteroides ovatus、Ruminococcus gnavus的变化与2型糖尿病相关表型的相关性。结果 (1)干预12周后与db/m组相比,db/db组小鼠粪样中Bacteroides ovatus水平显著降低(P0.010);恩格列净(P0.001)、马里苷(P0.050)、黄诺玛苷(P0.001)干预后能显著升高其含量,差异具有统计学意义。(2)与db/m组相比,db/db组小鼠粪样中Ruminococcus gnavus水平显著升高(P0.050);恩格列净(P0.050)、马里苷(P0.050)干预后能显著降低其含量,差异具有统计学意义。(3)Bacteroides ovatus水平与空腹血糖(FBG)、三酰甘油(TG)呈负相关(r=-0.420,P=0.021;r=-0.474,P=0.008);Ruminococcus gnavus水平与FBG、TG呈正相关(r=0.397,P=0.030;r=0.404,P=0.027)。结论马里苷、黄诺玛苷可以调节小鼠肠道菌群的变化,这可能是其抗糖尿病的重要机制。     

利用CRISPR-Cas9技术失活黑曲霉中果胶酶基因及突变株性能评价*

我国果胶酶制剂使用广泛但专一性不高,高效、专一的果胶酶制剂在市场上仍然匮乏。利用基因工程技术改造果胶酶生产菌株——黑曲霉来生产单一成分的果胶酶成为解决果胶酶应用需求的一种有效方案。构建一种高效的CRISPR-Cas9基因编辑技术,可为构建高产单一性果胶酶的黑曲霉底盘菌株提供有效的基因编辑工具。首先敲除产果胶酶黑曲霉基因组上的pyrG基因构建尿嘧啶营养缺陷型菌株AnΔpyrG,并在AnΔpyrG菌株的pyrG基因位点定点整合Cas9基因表达盒和pyrG基因表达盒,构建组成型表达Cas9基因的黑曲霉菌株AnCas9,再构建含有gpdA启动子、锤头结构核酶、HDV核酶的稳定性表达sgRNA的pLM2-sgRNA质粒,建立CRISPR-Cas9基因编辑体系。利用该技术失活AnCas9菌株中的2个聚半乳糖醛酸酶基因4978020和4983861来检测构建的CRISPR-Cas9基因编辑效率并检测4978020基因功能缺失菌株的表型变化和产酶变化,结果表明果胶酶基因编辑效率大于50%,AnΔ4978020的表型和果胶酶酶活性与出发菌株均无明显变化。在黑曲霉中成功构建了高效的Cas9基因编辑技术,4978020基因功能缺失也不影响菌株表型,为构建高产单一性果胶酶黑曲霉底盘菌株奠定基础。     

粉末包衣技术在药物制剂领域的应用研究进展

粉末包衣技术是薄膜包衣技术发展至今的一个重要分支,其在药物制剂领域的应用优势突出,近年来受到药剂学研究者的广泛关注。分类综述目前应用于药物制剂的几种主要粉末包衣技术,包括属于物理化学法中的凝聚法、溶剂蒸发法和熔融分散法以及物理机械法中的喷雾干燥法、喷雾冷凝法、干法包衣技术和气流悬浮包衣技术,并探讨粉末包衣技术的主要功用,如用于制备缓控释制剂、药物粉末表面改性、改善口服制剂感官效果和提高药物及制剂稳定性等。     

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱在医学真菌领域的应用进展

基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS）是近年来新兴的微生物检测技术,通过核糖体蛋白分析实现对真菌快速、准确鉴定。本文针对MALDI-TOF MS用于致病真菌鉴定、分类、体外抗真菌药物敏感性检测以及临床微生物样本直接检测等方面作一综述。     

Characterization of HSP-70 cognate proteins from wheat

Summary Animal and plant cells contain a family of constitutively expressed HSP-70 cognate proteins that are localized in different subcellular locations and are presumed to play a role in protein folding and transport. Utilizing antibodies raised against the yeast endoplasmicreticulum-localized HSP-70 cognate termed BiP/GRP-78, as well as antibodies raised against the Escherichia coli HSP-70 protein DnaK, we have identified and characterized a large family of closely related proteins in wheat. One protein band of 78 kDa that is apparently closely related to yeast BiP was localized in the endoplasmic reticulum. This band cross-reacted with the yeast BiP but not with the DnaK-specific antibodies. The yeast BiP antibodies also recognized a cytoplasmic protein of 70 kDa that is probably related to the HSC-70 cognate proteins. These two proteins were further confirmed as HSP-70 cognates by their ability to bind to an ATP-agarose column. Probing of proteins from purified wheat mitochondrial preparations with the yeast BiP and DnaK-specific antibodies showed that this organelle contained a family of HSP-70-related proteins. The yeast BiP antibodies recognized two mitochondrial proteins of 60 and 58 kDa, but failed to detect any protein in the size rang of 70 to 80 kDa. However, the presence of immunologically distinct proteins of 90 and 78 kDa, as well as of lower molecular weight from this family in the mitochondria, was shown by probing with the DnaK-specific antibodies. A new protein of 30 kDa, cross-reacting with anti-yeast BiP antibodies, was detected only in developing seeds, close to their maturity. The evolution of HSP-70 cognate proteins in wheat as shown in this study is discussed.     

野猪Toll 样受体基因的结构和功能鉴定

Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是介导天然免疫和获得性免疫的病原模式识别受体(Pattern recognition receptor,PRRs),能识别表达在病原微生物上高度保守的病原相关分子模式(Pathogen associated molecular patterns,PAMPs),并通过一定的信号转导途径引起核内相关基因的表达,启动和调节机体的免疫反应。     

一种快速提取质粒DNA用于鉴别重组克隆的方法

介绍了一种利用过夜培养的菌液瞬时提取质粒DNA,并用于电泳鉴别含有插入子克隆的方法。事先无需准备许多繁琐的相关试剂,提取质粒的全过程只需3~5min就可完成,非常适合于做重组克隆的快速鉴别。     

不同光质对烟草叶片组织结构及Rubisco羧化酶活性和rbc、rca基因表达的影响

通过对烟草植株覆盖白、红、黄、蓝、紫色滤膜获得不同光质,研究了烟草叶片在7～70d的生长发育期内,不同光质处理对烟叶组织结构特征、核酮糖1,5-二磷酸羧化酶/加氧酶（Rubisco）羧化酶活性、Rubisco基因（rbc）表达及其活化酶（Rca）基因（rca）表达的影响。结果表明,与黄膜处理下生长的烟叶相比,红、蓝、紫膜处理下生长的烟叶有较高的叶片厚度、栅栏组织厚度、海绵组织厚度、栅栏细胞密度和较小的组织空隙率。此外,红、蓝、紫膜处理的叶片有较高的Rubis-co羧化酶活性和净光合速率及较强的rbc和rca基因表达。实验结果表明不同光质对烟草叶片的组织结构特征有显著影响,光质可能通过影响Rubisco羧化酶活性进而影响叶片光合效率,而光质、叶片组织结构和光合效率之间存在某种程度的相互联系。     

基于无人机的冬小麦拔节期表层土壤有机质含量遥感反演

快速监测大面积分布的盐渍化麦田土壤有机质含量,可为推进盐渍土改良和促进碳循环研究提供数据支撑。通过野外采样与获取无人机遥感影像,分别基于裸土和植被情况,采用多元线性回归(MLR)、偏最小二乘回归(PLSR)和支持向量机回归(SVR)3种方法,建立区域有机质含量遥感模型,并进行检验和对比,确定最优的土壤有机质含量反演模型;最后基于最优模型进行研究区表层土壤有机质的反演,并与插值结果进行比较。结果表明: 经5×5的中值滤波处理后的光谱与土壤表层有机质对应最优;3种模型中,SVR模型的预测精度最高,PLSR次之,MLR效果最差。对比两种变量的建模效果,基于植被的SVR建模效果最好,其建模决定系数(R²)、均方根误差(RMSE)分别为0.89、0.20,验证R²、RMSE分别为0.82、0.24;基于裸土的建模效果不理想,最优的也是SVR模型,其建模R²、RMSE分别为0.63、0.26,验证R²、RMSE分别为0.61、0.25。根据最优模型反演得到该区域有机质含量为17.51～22.53 g·kg^-1,平均值为19.51 g·kg^-1,与实地调查结果较为一致;插值结果与反演结果相比,精度受到限制。综上,基于无人机多光谱可以对盐渍土冬小麦拔节期土壤有机质含量进行快速、大范围精准估测。