Enhanced production of recombinant nattokinase in Bacillus subtilis by the elimination of limiting factors

By systematic investigation, glutamate and a mixture of metal ions were identified as factors limiting the production of nattokinase in Bacillus subtilis. Consequently, in medium supplemented with these materials, the recombinant strain secreted 4 times more nattokinase (260 mg l⁻¹) than when grown in the unsupplemented medium.     

植物内生枯草芽孢杆菌纳豆激酶同源基因的序列分析及其在大肠杆菌中的表达

利用基因组学和生物信息学的方法,从一种植物内生枯草芽孢杆菌菌株Bs0922的基因组DNA中克隆了纳豆激酶的同源基因NK-Bs0922,长度为1 149 bp。通过重组和转化在大肠杆菌BL21(DE3)中表达了一个大小为48.0 kD的重组蛋白。     

纳豆激酶基因的优化设计、合成及其在烟草叶片中的瞬时表达

根据植物偏爱密码子优化设计、合成纳豆激酶基因sNK,利用重叠延伸PCR法在其中插入番茄果实特异性表达基因E8的第一内含子构成sNKi基因,通过农杆菌渗透法将这两种基因渗入到烟草NC89叶片中并实现瞬时表达。通过RT-qPCR法将两种基因在烟草叶片中转录水平的表达量进行比较,结果表明两种基因在烟草叶片中均表达,且sNKi基因的表达量显著高于sNK基因;通过纤维蛋白平板法在两种基因的瞬时表达样品中均能检测到纤溶酶活性,表明目的基因在烟草叶片中可正常翻译并表现出溶栓活性,且sNKi基因在翻译水平的表达量显著高于sNK基因。表明内含子对人工合成的纳豆激酶基因的瞬时表达具有显著的促进作用。     

纳豆激酶的分离纯化及生化研究

用固体发酵工艺制得的纳豆中含有大量溶栓活性成分———纳豆激酶。经过生理盐水浸提 ,(NH4 ) 2 SO4 分级沉淀 ,Sephadex柱层析等步骤 ,可以得一层析纯的纳豆激酶。冷冻干燥品经SDS—PAGE电泳显示有二组分存在     

纳豆激酶的发酵工艺研究

以实验室选育的纳豆菌— 6号 (Bacillusnatto 6)为出发菌株 ,研究其固液两种发酵条件对纳豆激酶溶栓活力的影响。研究表明 ,纳豆菌适于固体发酵 ,37℃下 2 4h ,其活力可达 1 60 0IU/g以上。     

纳豆激酶基因在大肠杆菌中的表达及活性分析

目的:构建纳豆激酶基因的表达载体,鉴定其在大肠杆菌中的表达及表达产物的生物活性鉴定.方法:以纳豆芽胞杆菌基因组为模板,PCR技术克隆出纳豆激酶基因的成熟肽序列,分别克隆进具有信号肽的pMAL-p2x及无信号肽pMAL-c2x质粒中,经酶切和测序鉴定其正确性,分别将重组质粒转化至大肠杆菌中表达.结果:成功构建的两组重组质粒在IPTG诱导下,均能分别在37℃及16℃条件下表达出可溶性的融合蛋白,SDS-PAGE胶检测证实重组质粒在大肠杆菌中可表达出相对分子量约76kDa的纳豆激酶蛋白.纤维蛋白平板实验证明两种融合蛋白均有活性,且有信号肽的融合蛋白的酶活较无信号肽的融合蛋白高.结果:成功构建了两组重组纳豆激酶基因的表达质粒,且该两组重组基因在大肠杆菌中可溶性表达并具有生物活性,因此为下一步研究表达产物纳豆激酶的功能、应用和生产奠定了基础.     

纳豆激酶的纯化及活力测定

利用SephadexG—100s柱凝胶层析法从纳豆菌（BacillusNatto）提取液中分离纯化出具有体外活性的纳豆激酶,并通过纤维蛋白平板法测定其纤溶活力,发现其具有较强的促进纤维凝块溶解的作用。     

Expression and purification of recombinant nattokinase in <Emphasis Type="Italic">Spodoptera frugiperda</Emphasis> cells

A recombinant baculovirus, rv-egfp-NK, containing a reporter gene encoding the enhanced green fluorescent protein (EGFP), was used to express nattokinase (NK), a fibrinolytic enzyme, in Spodoptera frugiperda (SF-9) cells. The recombinant protein also included a histidine tag for purification using Ni(2+) resins. The recombinant NK, approximately 30 kDa, retained fibrinolytic activity (60 U/ml). The integration of the EGFP expression cassette in the Bac-to-Bac system is thus an effective method for the expression and purification of recombinant NK protein in Spodoptera frugiperda insect cells.     

高效溶栓酶——纳豆激酶的纯化及酶学性质研究

采用硫酸铵分步盐析,Sepharose CM FF离子交换层析和Superdex 75凝胶色谱,对纳豆激酶发酵液进行分离纯化,得到电泳纯的纳豆激酶。并研究了纳豆激酶的酶学性质,实验结果表明,纳豆激酶的最适作用温度为37℃,温度对酶稳定性影响显著;NK的最适作用pH为7.4,pH6~8范围内酶活相对稳定;EDTA、pepstatin、aprotin ine和PMSF对酶有抑制作用,而SBTI和TPCK对酶有激活作用,其中以EDTA的作用最为明显;Zn2 对酶活有较大的抑制作用;A l3 、Cu2 对酶也有一定程度的抑制;Mg2 、Ca2 、是较好的酶活稳定剂和促进剂。     

一种有效提高纳豆激酶表达量的方法

为提高纳豆激酶在大肠杆菌中的表达量 ,在不改变蛋白质序列的前提下 ,对纳豆激酶氨基端编码前 2 0个氨基酸的序列进行改造 ,以降低此区域的GC含量及稀有密码子数量 ,其中有 3个位点直接采用T ,另有 4个位点采取不确定突变的方式 ,产生 1 6种组合 ,由此而得 1 6条序列 ,利用生物信息软件DNASISv2 5对这些序列的二级结构进行模拟 ,取得自由能绝对值最低的 6条序列设计引物 ,克隆至表达载体pET 3c,导入大肠杆菌BL2 1 (DE3) ,IPTG诱导表达 ,其中有 3株菌形成明显高效表达