菘蓝多倍体育种的研究

本文报道药用植物菘蓝(Isatis indigotica Foft.)同源四倍体的诱发、鉴定、选育的研究。用0.05-0.5％浓度的秋水仙碱水溶液处理萌发的种子,或用0.05-0.3％浓度的此溶液处理幼苗的生长点,均可以获得四倍体植株。最适宜的处理时间为6-12小时。除用直接的细胞学技术鉴定多倍体植株外,一些重要的间接鉴定特征,如叶表皮保卫细胞中叶绿体数,花粉沟数可作为鉴定本种多倍体植株的可靠指标。比较了四倍体植株和二倍体亲本的生物学特性。经过数代选育,获得了性状稳定、繁殖力正常、根与叶中活性成分均有较大幅度提高、生产性能良好的品系。     

板蓝根中靛玉红提取方法研究

采用薄层色谱分析比较了水煎法和渗漉法对板蓝根有效成分--靛玉红的提取效果,并对以前的提取方法做了改进,提高了靛玉红的提取效率。     

利用SpyTag/SpyCatcher构建胞内自组装多酶复合体实现高效生物合成

SpyTagr和SpyCatche可通过自发反应形成共价键,产生稳定的分子自组装体。酶分子自组装体因具有高效有序的催化特性在合成生物学和纳米技术领域具有重要的应用价值。为探索SpyTag/SpyCatcher在大肠杆菌胞内多酶复合体系形成有序自组装分子能力,将SpyTagr和SpyCatche分别与P450BM3m单加氧酶和葡萄糖脱氢酶GDH进行融合表达,以期产生具有辅酶再生循环系统、高效生物合成靛蓝分子的SpyTag/SpyCatcher双酶自组装复合体。首先,通过电泳及质谱对重组工程菌表达蛋白进行分析,证实SpyCatcher-P450BM3m与SpyTag-GDH在胞内成功形成了自组装多酶复合体;然后,系统分析不同培养条件下组装体合成靛蓝的能力。结果发现,经0.5mmol/L IPTG诱导后,菌体在16℃继续培养18h后,工程菌对吲哚(2mmol/L)与葡萄糖(4mmol/L)的全细胞催化能力最强,靛蓝产量最高达258mg/L,是未组装多酶系统的1.9倍,比P450BM3m单酶表达系统高约2.4倍;反应70min后达到反应平衡,转化率为52%。成功实现了SpyTag/SpyCatcher介导的多酶体系在大肠杆菌细胞中的自组装和高效转化体系,为胞内多酶复合物组装体的设计提供了新思路。     

催化吲哚生成靛蓝的细胞色素P450BM-3 定向进化研究

以催化吲哚产生的靛蓝在 630 nm 处具有特殊的吸收峰为高通量筛选指标,将来源于 Bacillus megaterium 的细胞色素 P450BM-3 单加氧酶的基因序列用易错聚合酶链式反应进行定向进化,通过多轮突变,在原有的能产靛蓝的高活力突变酶的基础上成功获得了三个高于亲本酶的突变酶,突变酶的酶活分别是亲本酶的 6.6 倍 (hml001) , 9.6 倍 (hml002) 和 5.3 倍 (hml003) ,并对突变酶的动力学参数进行了分析 . 突变酶 DNA 测序的结果表明, hml001 含有一个有义氨基酸置换 I39V , hml002 含有三个有义氨基酸置换 D168N , A225V , K440N , hml003 含有一个有义氨基酸置换 E435D ,这些突变位点有些远离底物结合部位,有些位于底物结合部位 .     

部分氧化的铁钼蛋白的圆二色散谱和电子顺磁共振谱的研究

棕色固氮菌固氮酶FeMo蛋白与过量（5－6个当量）的酸性靛蓝保温30－60分钟后,蛋白中的P－金属原子族全部氧化,然而蛋白中的FeMoCo全都处于还原状态。Na2S2O4使这种部分氧化的FeMo蛋白中的P-ciuster重新不,甲基紫精可加快这种还原,而亚甲蓝等氧化剂则使这种蛋白中的FeMoCo受到氧化,对这种部分氧化的FeMo蛋白分别进行CD还原滴定和测定氧化过程中的EPR／ABS的变化已经得到p-Cluster和FeMoCo的氧化还原当量数目。     

靛蓝对葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎小鼠肠道菌群作用研究

研究靛蓝对葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的溃疡性结肠炎（UC）模型小鼠的干预作用,并分析对小鼠肠道菌群的影响。

实验小鼠分为对照组、模型组、柳氮磺胺吡啶组（125 mg/kg）和靛蓝组（50 mg/kg),每组小鼠各9只。观察给药后小鼠体征并进行疾病活动指数（DAI）评分,通过苏木素―伊红（HE）染色观察小鼠结肠组织切片形态变化,ELISA法检测小鼠血清中IL-6、TNF-α、IL-1β、IL-8和IL-10水平;针对16S rRNA基因V4‒V5区进行高通量测序,分析小鼠肠道内容物的菌群变化。

与模型组相比,靛蓝组小鼠DAI评分降低,病理切片结果显示靛蓝可改善UC小鼠结肠黏膜损伤,减少炎性细胞浸润,血清中促炎因子IL-6、IL-8、IL-1β和TNF-α水平显著降低（t = 4.377 0、5.374 0、12.140 0、5.508 0,P = 0.011 9、0.005 8、0.000 3、0.005 3）,抑炎因子IL-10水平显著升高（t = 3.716 0,P = 0.020 5）。16S rRNA基因测序结果显示,模型组小鼠肠道菌群多样性降低,靛蓝组小鼠肠道菌群多样性升高。

给予靛蓝干预后可有效缓解UC小鼠结肠炎症状,通过降低炎症因子水平和调节UC小鼠肠道菌群平衡达到治疗UC的效果。

     

HPLC法对比不同产地南板蓝根药材靛蓝、靛玉红含量的研究

目的:以高效液相色谱法对广东不同产地(广东高要、广东罗定、广东罗浮、广东鼎湖)南板蓝根药材及常用伪品(爵床科植物广西马蓝)的主要成分靛蓝、靛玉红进行含量测定,对比不同产地南板蓝根药材靛蓝、靛玉红含量的差别.方法:采用HPLC法建立南板蓝根药材中靛蓝与靛玉红的含量测定方法.色谱条件:Kromasil C18(4.6mm×250mm,5μm);以甲醇-水(75:25)为流动相;检测波长:290nm;流速:1.0ml/min.柱温:40℃.结果:①靛玉红、靛蓝线性范围分别为1.652～33.04μg/ml、1.284～25.68μg/ml.回收率分别为98.92%,RSD=1.52%,N=5(靛玉红);102.61%,RSD=1.28%,N=5(靛蓝);②广西马蓝中未检测出靛玉红、靛蓝.结论:该方法操作简便、准确快速、重现性好,可完善现行的南板蓝根的药材质量标准,有效控制南板蓝根药材的质量.     

靛蓝生物合成酶的研究进展

靛蓝色素是人类所知最古老的色素之一,广泛用于食品、医药和印染工业。靛蓝最初由植物中提取获得,作为一种色泽艳丽、无毒无害、能够生物降解的环保型染料,深受青睐。生物合成靛蓝因其绿色、高效、节约土地、安全稳定等优点,作为取代目前植物提取及化学合成的主流途径,受到广泛关注。在过去的几十年中,许多天然酶和工程酶已筛选用于合成靛蓝。本文概述了能够催化靛蓝生物合成的酶及相关应用,并探讨了当前存在的问题和未来研究方向,为推进基于生物合成的靛蓝工业化生产奠定基础。     

靛蓝及其同类色素的微生物生产与转化

靛蓝类色素广泛应用于印染、食品和医药工业, 其环境友好的合成或生产途径越来越受到人们的关注, 特别是微生物生物合成。已经鉴定和分离了能够合成靛蓝类色素的多种微生物, 并且明确了起催化作用的主要是单加氧酶和双加氧酶。已经克隆和利用了一些加氧酶的基因, 构建了工程菌, 优化了其发酵过程。同时, 微生物合成靛蓝的生物转化也已经起步。这些进展将带来环境友好的靛蓝类色素的合成与生产。