一种真核细胞分泌型重组融合蛋白rPC的构建、表达与纯化

抑制性免疫检查点PD-1或CTLA-4靶向治疗药物已用于肿瘤的临床治疗,但单一靶点药物会有耐药发生,联合使用同时封闭多个靶点可提高疗效,因此拟构建一个可封闭多个靶点的新型重组蛋白。首先设计并合成了一个由人类PD-1和CTLA-4两个受体的胞外功能域组成并且C端带6×His标签的分泌型重组融合蛋白rPC编码序列,插入真核细胞表达载体pLVX-IRES-ZsGreen1,稳定转染HEK293细胞,收集细胞培养上清,以亲和方法纯化重组蛋白rPC,通过实时荧光定量PCR检测多个人类肿瘤细胞系中PD-1配体PD-L1、PD-L2和CTLA-4配体CD80、CD86的表达,以选择相对高表达的细胞,利用细胞免疫荧光染色方法检验rPC与肿瘤细胞的结合能力,并用CCK-8法检测rPC是否对肿瘤细胞的生长有影响。结果表明,重组融合蛋白rPC可由稳定转染表达载体的HEK293细胞表达并分泌,纯化后的rPC可以与PD-1和CTLA-4配体表达相对较高的肺癌细胞NCI-H226结合,并且rPC处理对其生长并无直接影响,与预期一致。成功获得的重组融合蛋白rPC可用于进一步的体内外功能研究,也为今后研发新型多靶点肿瘤免疫治疗蛋白药物打下了坚实的基础。     

古田山国家级自然保护区白颈长尾雉的分布格局及其季节变化

为了解浙江省古田山国家级自然保护区内白颈长尾雉(Syrmaticus ellioti)的分布格局和季节变化, 2014年5月至2016年4月, 我们对其进行了为期2年的网格化监测。共有44个公里网格拍摄到白颈长尾雉, 独立探测数量为211次, 雌雄性比为1 : 1.64。白颈长尾雉主要分布在实验区和缓冲区, 其探测率在常绿落叶阔叶混交林、杉木(Cunninghamia lanceolata)林、针阔叶混交林、人工油茶(Camellia oleifera)林和常绿阔叶林中依次递减, 主要分布在海拔600-800 m。冬、春两季, 白颈长尾雉活动强度和区域相对较小, 而夏、秋两季活动强度和区域相对增加, 其分布在海拔段(F_4,12 = 3.76, P < 0.05)和季节间(F_3,12 = 3.34, P < 0.05)都存在显著差异。对海拔和气候因子进行回归分析发现, 日平均气温和海拔对白颈长尾雉是否出现均有极显著影响(P < 0.01); 白颈长尾雉月探测率和探测到白颈长尾雉位点的海拔均与月平均气温呈极显著正相关(P < 0.001), 而与月平均降水量无显著线性关系(P > 0.05)。这表明白颈长尾雉的活动在很大程度上受海拔和气温影响, 随月平均气温的升高有向高海拔迁移的趋势。模型选择和多模型推断显示, 最优模型仅保留“100 m内水源”这一个变量, 次优模型是“100 m内水源 × 海拔”, 最优和次优模型的权重分别为0.18和0.14, “100 m内水源”和“海拔”是影响白颈长尾雉在保护区内分布的重要因子, 重要值分别为0.82和0.51。因此, 白颈长尾雉的分布并非仅由某一个或几个环境变量决定, 而是由多个环境变量共同决定。气温的变化和对不同海拔段的选择是导致白颈长尾雉形成不同季节分布格局的原因。     

猪肠道冠状病毒与入侵受体氨基肽酶N的相互作用

猪肠道冠状病毒是目前危害养猪产业的重要病原。目前已发现能够感染猪肠道的致病性冠状病毒有4种：猪传染性胃肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、猪丁型冠状病毒和猪肠道甲型冠状病毒。冠状病毒感染宿主的第一步是识别宿主细胞膜受体分子并与之结合,随后启动入侵及膜融合进而使病毒基因组进入宿主细胞内部。因此,冠状病毒受体是决定其宿主范围及组织嗜性的关键因素。确定冠状病毒受体及病毒与受体的结合机制对预防新发病毒及开发冠状病毒治疗性药物具有重要意义。猪传染性胃肠炎病毒利用猪氨基肽酶N（aminopeptidase N,APN）作为感染宿主的功能性受体,并利用唾液酸作为辅助结合因子。猪APN最初也被鉴定为猪流行性腹泻病毒的功能性受体,但近年的研究结果与前面的报道存在较大的差异,产生了较大的争议。最近的研究认为,猪丁型冠状病毒的功能性受体也是APN,并且猪丁型冠状病毒能够利用多个物种的APN作为功能性受体,这与其跨物种传播具有密切关系。最新发现的猪肠道甲型冠状病毒则不使用APN作为其入侵受体。本文综述了前面3种猪肠道病毒感染宿主细胞的受体及结合机制的研究进展,并比较分析了猪APN及唾液酸在不同猪肠道冠状病毒入侵宿主过程中结合方式的异同,为进一步研究新发猪肠道冠状病毒受体提供参考。     

ATMYB123和ATKOR1基因参与拟南芥根发育的调控

从拟南芥T-DNA插入突变体库中筛选到2个根发育相关基因ATMYB123和ATKOR1表达缺失的突变体atmyb123和atkor1,通过杂交构建这两个基因表达缺失的双突变体atmyb123/atkor1,以明确这两个基因在根发育中的作用。结果显示:(1)ATMYB123表达缺失突变体atmyb123植株地上部分发育减缓,种皮颜色变黄,而ATKOR1表达缺失突变体atkor1植株在这两方面与其野生型没有明显差异;两基因缺失均显著影响了拟南芥根的发育,根生长受到了严重抑制。(2)双突变体atmyb123/atkor1在植株形态和种皮颜色方面表现出单突变体AT-MYB123的特点,而其根长却介于两单突变体的中间。(3)进一步研究发现,培养基pH改变、NaCl处理、外源GA施用均没有改变突变体根生长趋势,显示这3种因素与两基因缺失突变引起的根发育抑制无关。研究表明,AT-MYB123和ATKOR1基因参与拟南芥根的发育调控,转录因子ATMYB123可能作为主调控因子参与ATKOR1对拟南芥根发育的调控。     

嘉庚蛸精子形成过程中KIFC1类似物与NUP62分布的免疫荧光分析

精子发生（spermatogenesis）是受基因调控的复杂的发育过程,精子形成不同阶段生精细胞内基因特异性表达导致顶体的发生、精核形态的建成及尾部的形成,精细胞内特有的微管套（manchette）和活动于微管套上的各种分子马达（molecularmotor）在上述各结构形成中发挥重要作用。     

鲫鱼Rag基因的克隆及表达分析

DNA重组激活基因(Recombination activating genes RAG)是脊椎动物特异性免疫反应的关键基因,也是脊椎动物进化分析的标记基因之一.鲫鱼具有很强的适应性和抗病能力,是我国广泛养殖的重要经济淡水鱼;由于具有不同的倍性和丰富的遗传多样性,又是研究鱼类基因组进化的独特材料.本研究用PCR方法扩增、克隆了鲫鱼的Rag基因.鲫鱼Rag1基因从起始密码到终止密码总长4188bp,由三个外显子和两个内含子组成,其中开放阅读框长3192bp,编码1063个氨基酸.Rag2基因从起始密码到终止密码总长1593bp,没有内含子,只有单一的编码区,编码530个氨基酸.Rag1和Rag2基因的ORF和氨基酸序列在不同鱼类中的对比结果表明其在进化过程中非常保守.不同鱼类Rag1基因的第二内含子也是高度保守的,转录因子结合位点分析表明在第二内含子的保守区域中有许多转录因子的可能结合位点.其中有一段在所有已知鱼类中都存在的保守区域是与性腺发育相关的转录因子SRY和SOX5的可能结合位点,提示Rag1基因的表达可能与性腺发育具有相关性.用RT-PCR方法进行的组织特异性表达分析表明Rag1基因在鲫鱼成体的头肾和精巢都能检测到表达,提示Rag基因不仅主导了免疫组织中的DNA重组,也可能参与了生殖细胞的DNA重组.RT-PCR检测证明Rag1基因在鲫鱼胚胎发育至第5天开始表达,在第7天鲫鱼胚胎的胸腺原基中可检测到Rag1基因mRNA的杂交信号,在第9天鲫鱼胚胎的胸腺原基中可以检测到很强的Rag1 mRNA原位杂交信号,说明该时期可能是鲫鱼免疫基因重组的活跃时期.     

基于结构域活性分析的大肠杆菌T蛋白结构研究

大肠杆菌T蛋白含有三个结构域:分支酸变位酶、预苯酸脱氢酶和调节结构域。文章作者分段克隆了T蛋白的分支酸变位酶、预苯酸脱氢酶和调节结构域等片段,并对其进行了活性研究。研究发现,定位于N末端的分支酸变位酶结构域的比活性虽然不高,而稳定性较好;同时拥有调节结构域和预苯酸脱氢酶结构域的C末端片段,其预苯酸脱氢酶比活性的剩余百分率虽然高于分支酸变位酶结构域,但稳定性较差。作者进而表达了C末端切除38个氨基酸的T/1-336片段,发现预苯酸脱氢酶活性彻底丧失,而其分支酸变位酶和调节结构域的活性却基本保留。这说明T蛋白中分支酸变位酶结构域拥有一个相对独立、完整的结构,而预苯酸脱氢酶结构域和调节结构域交织共存,结构松散。     

中国鸡皮衣属地衣3新记录种

鸡皮衣属(Pertusaria)隶属于子囊菌门(Ascomycota)、茶渍纲(Lecanoromycetes)、鸡皮衣目(Pertusariales)、鸡皮衣科(Pertusariaceae)。在对鸡皮衣属地衣进行研究时,发现3个中国新记录种,即异亚澳鸡皮衣(P.allothwaitesii),刚硬鸡皮衣(P.rigida)和赭色鸡皮衣(P.colorata)。该文对这3个种的分类学特征进行了详细描述,并提供了其相关图片。     

白颈长尾雉微卫星多态性的遗传学分析

采用7个微卫星位点遗传标记,对白颈长尾雉(Syrnaticus ellioti)4个地理种群105个个体进行了种群遗传分析。研究发现4个地理种群均偏离Hardy-Weinberg平衡,共检测到62个等位基因,平均等位基因数目为8.86;大多数微卫星位点的观察杂合度值较低,平均为0.504,要明显低于期望杂合度。7个位点的多态信息含量为0.549～0.860,平均为0.712。用无限等位基因模型、逐步突变模型和双相突变模型对4个地理种群的种群瓶颈效应检测,发现各种群近期内都经历过瓶颈效应的影响。地理种群之间的Fst值表明,贵州与湖南地理种群间的分化达到了极显著水平(P<0.001);由Nei氏的无偏遗传距离所构建的邻接树显示,贵州地理种群与湖南地理种群的遗传关系较远。微卫星对不同地理种群的分层分子变异分析(贵州地理种群对其他地理种群)发现:来自地理种群间和组群间的遗传变异量相对较小;而同一地理种群内个体之间的变异量较大(92.84%),且达到显著水平。     

真皮成纤维细胞成骨分化的实验研究

目的比较不同诱导剂对真皮成纤维细胞成骨分化的不同影响,探讨成纤维细胞成骨分化机制。方法取新生大鼠皮肤进行组织块培养,真皮成纤维细胞分离培养及鉴定,并分别由地塞米松、1,25(OH)2D3以及地塞米松和1,25(OH)2D3进行成骨分化诱导。分别于诱导后14d行ALP含量测定,21d行茜素红染色,并进行TAZ表达检测。结果真皮成纤维细胞表达波形蛋白,不表达角蛋白;成纤维细胞诱导14d后,1,25(OH)2D3诱导组及地塞米松+1,25(OH)2D3诱导组ALP含量与对照组有显著差异;成骨诱导21d,地塞米松诱导组仅见少量散在红色钙结节形成,1,25(OH)2D3诱导组钙结节数量增高,地塞米松+1,25(OH)2D3诱导组钙结节数量明显增高,直径变大;1,25(OH)2D3诱导组及地塞米松+1,25(OH)2D3诱导组,经TAZ免疫荧光染色,可见部分细胞核表达TAZ。结论地塞米松可促进1,25(OH)2D3诱导真皮成纤维细胞成骨分化。