克氏原螯虾一种诱导型HSP70基因克隆及分析

克氏原螯虾是我国淡水虾类养殖的重要品种,具有很强的抵御各种环境胁迫和各种刺激的能力。本文以该虾为对象,通过基因克隆以及从基因水平探讨HSP70s与环境应激之间的关系,为深入研究水生无脊椎动物HSP70s功能提供基础。采用RT-PCR和RACE方法从克氏原螯虾（Procambarus clarkii）心脏组织中克隆得到一种HSP70 cDNA（scHSP70）,其全长为2271bp,包括1902bp的完整编码序列、142bp的5′及221bp的3′端非翻译区, GenBank登陆号DQ301506。基因组DNA扩增表明该基因仅由一个外显子组成。根据cDNA序列推导出scHSP70由635个氨基酸组成,分子量为69.6kD,理论等电点为5.34。该序列存在真核细胞HSP70家族的三个特征标签。SWISS-MODEL蛋白三维结构预测显示scHSP70在N端形成ATP酶结构域,在近C端形成底物肽结合结构域。克氏原螯虾在系统发生树上的进化地位与传统分类学相一致。半定量RT-PCR实验表明,scHSP70有广泛的组织分布,在心脏中表达量最高,在血液中最少。热激后该基因大量表达,说明该基因是一种诱导型HSP70。这为从蛋白水平研究克氏原螯虾HSP70与环境应激之间的关系提供基础。     

HCMV UL97 mRNA序列特异性M1GS的构建及其体外切割活性研究

HCMV UL97基因编码一种蛋白激酶,该酶参与调控病毒DNA的复制和衣壳的形成,且序列异常保守,可作为抗HCMV治疗的重要靶位。基于HCMV UL97 mRNA T3位点附近的序列,设计一段与该位点互补的引导序列（Guide Sequence,GS）,并将其与大肠杆菌核酶P催化亚基（M1 RNA）的3’末端共价连接,构建了一种序列特异性的M1GS（M1-T3）。体外实验证实,所构建的M1-T3可与UL97 mRNA的T3位点特异性结合并产生有效的切割作用。进一步研究M1-T3的结构与其对底物片段靶向切割活性的关系,结果发现在M1 RNA与GS之间增加一段88核苷酸桥连序列的M1-T3（即M1-T3’）,其靶向切割活性大大增强。此外,去除M1-T3 3’末端的CCA序列,其靶向切割活性将基本丧失。上述结果表明,这段桥连序列和3’末端的CCA序列是M1-T3重要的结构元件。这不仅有助于阐明M1GS与其底物的相互作用机制,同时也为进一步评价M1-T3在体内对UL97基因表达及病毒复制的抑制活性奠定了基础。     

大亚湾海域锥状斯氏藻孢囊形成与萌发的季节变化

锥状斯氏藻(Scrippsiella trochoidea)是南海大亚湾海域优势甲藻。为了解该藻孢囊形成和萌发动态及其对营养细胞种群动态的影响,2001年1月-2002年1月在大亚湾澳头海域用沉积物捕捉器及TFO重力采泥器对其孢囊进行每月一次的周年监测,同时对浮游植物、水温、盐度、溶解氧等也进行了监测。孢囊形成和萌发分别以沉积物捕捉器中的孢囊形成率以及上表层沉积物中空孢囊的百分比来表示。钙质孢囊和非钙质孢囊年平均形成率分别为1.11×104 cysts m-2d-1和2.13×105 cysts m-2d-1。前者在冬季大量形成,而后者在夏季形成较多。孢囊多在春秋季节萌发,夏季萌发较少,而冬季几乎不萌发。在5月份和10月份营养细胞数量峰形成前,孢囊的萌发出现了高峰,而表层沉积物中的孢囊数量及孢囊形成率则在营养细胞数量峰后大幅度上升。由此可见,大亚湾沉积物中该藻孢囊的萌发给水体提供了丰富的营养细胞,反之水体中高密度营养细胞又促使孢囊的大量形成,从而造成了锥状斯氏藻赤潮在大亚湾海域接连发生。     

荧光互补与光能量共振转移检测B类G蛋白偶联受体PAC1二聚化

G蛋白偶联受体（G—protein couple receptors,GPCRs）是最大的超家族膜受体,其中它的B家族成员垂体腺苷酸环化酶激活肽（PACl）是垂体腺苷酸环化酶激动多肽（PAcAP）的特异受体,介导PAcAP神经保护等功能,是神经系统疾病药物开发的重要靶点之一。二聚化或寡聚化是GPCRs普遍存在的现象,但是目前尚没有关于PACl形成同源二聚体或寡聚体的报道。为了验证PACl也能进行同源二聚化,该文采用生物发光能量转移（bioluminescence resonance energy transfer,BRET）方法进行检测,结果显示不同浓度梯度共转染中国仓鼠卵巢细胞（Chinesehamsterovary,CHO）的PACl一Rluc与PACl一EYFP重组载体,在底物腔肠素h（coelenterazineh）作用下呈现明显的BRET信号。双分子荧光互补（BiFc）检测显示,带有EYFPN端基因标记的PACl与带有EYFPC端基因标记的PACl共转染CHO细胞,能呈现完整的EYFP荧光信号。同时,Westemblot检测也显示,高表达PACl的细胞中可检测到JPACl二聚体的大分子。因此,PACl是能够进行正常同源二聚化的,这个发现将为后续神经损伤药物的开发奠定全新的理论基础,同时也为其他GPCRs同源二聚化的研究起到启发和借鉴作用。     

流速对不同浮游藻类的生长影响研究

为了研究流速对不同浮游藻类生长的影响, 于 2015 年 3 月采集东江流域广东惠州河段原水, 在环形有机玻璃水槽中分别培养铜绿微囊藻、斜生栅藻和小环藻, 通过调整水体流速, 研究不同流速对不同藻类的细胞密度、叶绿素 a 浓度、最大比增长率和叶绿素荧光参数 Fv/Fm 的影响。结果表明, 在不同流速条件下, 不同浮游藻类的生理生化特征有所差异; 铜绿微囊藻表现为在不同流速条件下生长状况都较弱; 斜生栅藻和小环藻在低流速(<0.075 m·s–1)条件下繁殖速度较快, 且随着水体流速的增加, 对藻类生长有促进作用, 而在较高流速(>0.075 m·s–1)条件下随着流速的增加, 藻类的生长受到抑制。可见, 不同持续的流动条件是影响浮游藻类数量和生理指标变化的重要原因。该研究为东江水源的流速流量调节控制富营养化和水华防治提供技术支撑。     

实验室培养球形棕囊藻溶血毒素的提取、分离及其生成特征

研究从实验室培养的球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)提取溶血毒素的条件,探讨不同生长期球形棕囊藻溶血毒素的生成特征,用薄层色谱法对溶血成份进行了初步分析。结果表明,球形棕囊藻细胞壁的超声波破碎最适条件为：功率600W,4℃下处理30min。对数生长期、平稳期和衰亡期藻细胞适宜处理量分别为每次3000、2000、1000ml;在球形棕囊藻生长的平稳期和衰亡期具有明显的溶血活性,对数生长期溶血活性很低,甚至检测不到。球形棕囊藻溶血毒素至少含有4种糖脂类化合物。