信号识别颗粒调控蛋白转运系统

蛋白质是一类重要的生物大分子。在蛋白质转运系统中,很多蛋白质在核糖体中合成,然后通过内质网或质膜的转运到达相应的细胞器发挥生物学功能。蛋白质的分泌表达途径总共分为三类,分别为Sec分泌途径、双精氨酸途径和信号识别颗粒转运系统。本文简要介绍蛋白质的基本转运途径,主要介绍由信号识别颗粒所介导的蛋白质转运。分别概述信号识别颗粒及其受体的组成与功能,并对其调控途径做简要的介绍;同时也简单介绍与其相关的Yid C膜蛋白家族;对信号识别颗粒蛋白调控系统存在的必需性提出新的见解。     

基于时间序列转录组筛选谷氨酸棒杆菌内源高效组成型启动子

启动子是重要的转录调控元件,广泛用于工业菌株的代谢工程改造。谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum是重要的氨基酸生产菌株,但已报道的组成型强启动子较少。对谷氨酸高产菌Corynebacterium glutamicum SL4发酵过程的10个时间点样品进行转录组测序,筛选在发酵过程中稳定转录并且转录水平最高的10个基因;分别克隆其启动子序列至红色荧光蛋白(RFP)报告系统,通过荧光强度表征启动子在SL4菌株中的强度,再在野生型C. glutamicum ATCC 13869和ATCC 13032中验证部分启动子的通用性;并采用LacZ蛋白进一步评价强启动子的表达效果。结果显示,成功筛选到3个可以通用的组成型启动子P_(cysK)、P_(gapA)和P_(fumC)。其中P_(cysK)的表达强度最高,与诱导型强启动子P_(tac)对比,在SL4和13869菌株中均达到其2倍(RFP)和4倍(LacZ)以上;在ATCC 13032菌株中,P_(cysK)的表达强度为P_(tac)的0.3-0.4倍。Pcys K首次被报道为强启动子,可用于谷氨酸棒杆菌强化合成途径的代谢工程改造。     

敲除MIG1和SNF1基因对酿酒酵母共利用葡萄糖和木糖的影响

Mig1和Snf1是酿酒酵母葡萄糖阻遏效应的两个关键调控因子。为了提高酿酒酵母工程菌同时利用葡萄糖和木糖的能力,分别对MIG1和SNF1基因进行了单敲除和双敲除,并通过摇瓶发酵实验和RNA-Seq转录组分析,初步揭示了Mig1和Snf1可能影响葡萄糖和木糖共利用表达差异基因的层级调控机制。研究结果表明,MIG1单敲除对混合糖的共利用影响不大;SNF1单敲除会加快混合糖中木糖的利用而且葡萄糖和木糖可以被同时利用,这可能归因于SNF1单敲除会解除对一些氮分解代谢阻遏基因表达的抑制,从而促进了细胞对氮源营养的利用;进一步敲除MIG1,会解除更多氮分解代谢阻遏基因表达的抑制,以及一些碳中心代谢途径基因表达上调。虽然MIG1和SNF1双敲除菌株利用葡萄糖加快而利用木糖变慢,但是葡萄糖和木糖可以被同时利用,进而加快乙醇的积累。综上所述,MIG1和SNF1的敲除导致氮分解阻遏基因表达上调,有助于促进葡萄糖和木糖的共利用;解析Mig1和Snf1对氮分解阻遏基因的层级调控作用,为进一步提高葡萄糖和木糖的共利用提供新的靶点。     

葡萄穗霉中β-甘露聚糖酶基因在黑曲霉中的表达及酶学性质

【目的】以黑曲霉(Aspergillus niger)为宿主菌来表达葡萄穗霉(Stachybotrys chartarum)中的β-甘露聚糖酶(β-mannanase)基因。【方法】通过对葡萄穗霉全基因组进行比对分析,获得编码β-甘露聚糖酶基因s16942和s331的序列信息,通过设计引物,PCR扩增得到基因s16942和s331,连接到载体pGm上,并转化到黑曲霉中,获得的转化子经过amdS二筛平板复筛,测序验证,得到高效表达此基因的工程菌株G1-pGm-s16942和G1-pGm-s331。【结果】SDS-PAGE检测结果显示,G1-pGm-s16942和G1-pGm-s331表达的蛋白分子量大小分别约为48 kDa和60 kDa,且阴性对照中没有此条带。粗酶液的酶学性质表明,G1-p Gm-s16942表达的β-甘露聚糖酶的最适反应温度为60°C,最适反应pH为7,粗酶液的酶活最高达521 U/mL;G1-p Gm-s331表达的β-甘露聚糖酶的最适反应温度为50°C,最适反应pH为7,粗酶液的酶活最高达84 U/mL。【结论】本研究首次将葡萄穗霉的β-甘露聚糖酶基因转化到黑曲霉中并成功表达,并且具有较高的活性。     

2014工业生物技术专刊序言

工业生物技术是解决人类目前面临的资源、能源及环境危机的有效手段。本期专刊结合第七届中国工业生物技术发展高峰论坛,报道了我国工业生物技术领域专家学者在生物信息学、微生物细胞工厂的模拟设计与构建、工业发酵工程、工业酶的改造与应用、高通量筛选方法等领域取得的最新研究进展。     

新型生长快速需钠弧菌基因组无痕编辑体系构建

需钠弧菌Vibrio natriegens作为近几年发展起来的一种新型生长快速底盘细胞,在合成生物学领域展现出良好的应用前景。基因组编辑是合成生物学研究中不可或缺的遗传操作手段。但是,开展需钠弧菌的合成生物学研究仍然有待进一步发展精准、高效的基因组编辑系统。针对这个问题,首先对6株需钠弧菌的生理表型进行检测,选取生长快速、表型稳定的CICC 10908菌株作为基因组编辑研究的宿主细胞。其次,建立并优化需钠弧菌自然转化系统。优化后的系统将筛选标记基因cat-sacB或KanR整合到需钠弧菌染色体上的同源重组效率分别达到4×10–5和4×10–4。再次,在优化的自然转化系统基础上,利用双向选择性筛选方法,建立了精准、高效的需钠弧菌基因组无痕编辑体系。通过测试,基因敲除、回补、插入和替换这4种不同类型基因编辑的阳性率分别为93.8%、100%、95.7%和100%。最后,需钠弧菌可以实现质粒的高效转化和消除。该工作为需钠弧菌合成生物学研究提供精准、高效的基因组无痕编辑手段。     

甲羟戊酸途径限速步骤研究及其在产番茄红素重组大肠杆菌中的应用

甲羟戊酸途径(MVA途径)被引入重组大肠杆菌中,能够提高重组大肠杆菌中萜类化合物的合成能力。但因重组大肠杆菌中萜类化合物合成途径中间产物积累,导致细胞生长和萜类化合物合成受到限制。本研究在稳定表达MVA途径以及优化2-甲基-D-赤藻糖醇-4-磷酸途径(MEP途径)、番茄红素合成途径关键基因表达的重组大肠杆菌LYC103中,用质粒高表达MVA途径和番茄红素合成途径关键基因,挖掘该途径的限速步骤。结果表明,ispA、crtE、mvaK1、idi和mvaD基因过表达后,细胞生长没有明显变化,番茄红素产量依次提高了13.5%、16.5%、17.95%、33.7%和61.1%,说明这几个基因可能是合成番茄红素的限速步骤。mvaK1、mvaK2、mvaD三个基因在同一操纵子上,用mRNA稳定区(RNA stabilizing region)进行启动子文库(mRSL)调控mvaK1,相当于对3个基因同时调控。用高效基因组编辑技术(CAGO)对mvaK1基因的mRNA稳定区进行启动子文库的调控,得到菌株LYC104。番茄红素产量与对照菌株LYC103相比增加了2倍,细胞生长提高了32%。然后,利用CRISPR-Cas9技术在染色体lacZ位点整合idi基因,得到LYC105菌株。与出发菌株LYC103相比,细胞生长提高了147%,番茄红素产量增加了2.28倍。本研究在染色体上具有完整MVA途径的基础上,利用质粒高表达单个基因挖掘限速步骤,用同源重组方法整合限速基因、解除限速,为代谢工程构建高产菌株提供新策略。     

基于CRISPR/Cas系统的黑曲霉基因组编辑技术

黑曲霉Aspergillus niger是有机酸与酶制剂的重要工业生产菌株,以极端环境耐受性、高生产经济性、强发酵鲁棒性与高食品安全性等优势成为不可多得的细胞工厂。合成生物学与系统生物学的快速发展,不仅拉开了全面揭示黑曲霉细胞工厂高效运转机制的序幕,而且为高效黑曲霉细胞工厂的创建优化提供了新技术体系。作为新一代的基因组编辑技术,基于CRISPR/Cas系统的基因组编辑技术为黑曲霉基因组定向改造与基因表达调控带来了革命性突破。本文重点综述该技术在黑曲霉中的最新进展及其在黑曲霉基因编辑与表达调控中的应用,并对其未来发展方向进行展望。     

芳香族化合物微生物代谢工程研究进展

代谢工程从20世纪90年代初期发展至今已有近30年历史,对微生物菌种改良和选育工作起到了极大的推动作用。芳香族化合物是一类可以通过微生物发酵生产的化学品,广泛应用于医药、食品、饲料和材料等领域。利用代谢工程手段对莽草酸和芳香族氨基酸合成途径进行理性改造,微生物细胞可以定向地大量积累人们需要的各种芳香族化合物。笔者对近30年来国内外代谢工程改造微生物合成各种芳香族化合物的研究策略和生物合成途径进行了梳理和总结,以期为开展相关研究提供参考。     

大肠杆菌合成启动子的构建及在顺,顺-粘康酸生物合成中的应用

启动子是基因表达调控的重要元件.在代谢工程和合成生物学研究中,经常需要利用不同强度的启动子对代谢途径进行精细调控,来实现代谢平衡,降低中间产物积累,提高目标产物合成.然而目前可获得的启动子难以满足以上要求,而且不同来源的启动子通用性差,缺乏标准化.针对这些问题,设计了1条88个碱基对的启动子,包含典型的-35区、-10区以及核糖体结合区.同时,在转录起始位点上游6个碱基、-35与-10区间隔区14个碱基对中引入简并序列,构建了合成启动子文库.利用合成启动子控制红色荧光蛋白mCherry的表达强度,经过两轮筛选,从5 000多个克隆中获得了720个不同强度的启动子.随机挑选35条不同强度的启动子进行测序分析,结果表明不同强度的启动子具有碱基偏好性.对于强启动子,-13位点嘌呤碱基出现频率高,转录起始区除-4位点外,嘧啶碱基出现的频率高于嘌呤碱基,而-10区与-35区间14个位点的嘌呤碱基与嘧啶碱基出现频率大致相当.最后选取5条不同强度启动子应用于顺,顺-粘康酸合成途径调控优化,结果显示不同强度的启动子可以调节目标产物顺,顺-粘康酸的合成和中间产物儿茶酚的积累.