响应面分析法优化当归粗多糖提取工艺

选取岷县当归药材为原料,采用水提醇沉法进行多糖提取,以当归粗多糖得率为指标,探讨加水量、回流提取时间、水提液的浓缩比、醇沉后所达含醇比例对当归多糖得率的影响。在单因素分析的基础上,采用响应面分析法(RSM)确定了当归粗多糖最佳提取条件为:加水量837.6 mL/100 g,浓缩后溶液体积为228.12 mL,最终含乙醇浓度为65.80%,回流提取时间2 h,在此条件下预测当归粗多糖得率理论的最佳值为10.44%,实际验证值为10.40%,两者相符,说明RSM法分析的可靠性。     

桃Pp4CL2基因的克隆及抗寒功能验证

基于‘丁家坝李光桃’抗寒转录组数据,采用RT PCR技术克隆桃4 香豆酸辅酶A连接酶基因(Pp4CL2),并对其进行生物信息学及转化模式植物拟南芥和烟草的抗寒分析,以解析‘丁家坝李光桃’的抗寒机制。结果显示：(1)成功克隆获得桃Pp4CL2基因(登录号：LOC18792923),其cDNA序列为1 635 bp,编码544个氨基酸残基,具有4CL基因家族保守结构域。(2)二级结构分析显示,Pp4CL2蛋白由4种状态的二级结构组成,其中α螺旋占30.51%、β 折叠占7.35%、不规则卷曲及延伸链分别占41.54%和20.59%。(3)顺式作用元件分析发现,Pp4CL2基因上游启动子区含有光、低温以及多种激素响应元件。(4)序列系统进化分析显示,桃Pp4CL2与杏(Prunus armeniaca)、欧洲甜樱桃(Prunus avium)和梅(Prunus mume)的蛋白相似性最高,分别为99.08%、97.98%和96.14%。(5)成功构建转化载体Pp4CL2 pRI101,对拟南芥和烟草进行遗传转化并通过PCR鉴定获得转基因拟南芥和烟草。(6)与野生型相比,低温胁迫下转基因拟南芥和烟草的Pp4CL2基因相对表达量高,受冷害程度轻,具有更高的渗透调节物质含量和抗氧化酶活性,对低温具有更强的耐受性。研究表明,过表达Pp4CL2基因可增强植物对低温的耐受性,推测Pp4CL2基因在‘丁家坝李光桃’响应低温胁迫过程中具有重要作用。     

来源于麦氏喙枝孢霉的玉米赤霉烯酮水解酶在毕赤酵母中的高效表达及活性分析

【背景】玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)及其衍生物是一群具有雌激素活性的霉菌毒素,广泛存在于被霉菌污染的谷物中,造成食品业和畜牧业的巨大损失。利用专一性高的水解酶进行生物转化可有效去除玉米赤霉烯酮。【目的】构建高效表达玉米赤霉烯酮水解酶的酵母系统,以促进玉米赤霉烯酮水解酶的研究和工业应用。【方法】将来源于麦氏喙枝孢霉(RhinocladiellamackenzieiCBS650.93)的Rmzhd基因转入毕赤酵母中,筛选获得高效表达菌株,通过高效液相色谱分析发酵液中重组酶的性质。【结果】发酵液中Rm ZHD对ZEN的酶活力为16.67 U/m L,对α-ZOL的酶活力为9.85 U/m L。SDS-PAGE检测表达产物的分子量,与理论值30.7k D符合,且发酵上清液蛋白纯度高。Rm ZHD的最适p H值为9.6,最适温度为45°C,并具有较好的耐热性。【结论】研究结果为玉米赤霉烯酮水解酶的异源表达及其潜在的工业应用提供了一定的指导。     

hTNFR1在大肠杆菌中可溶性表达及纯化

将人源肿瘤坏死因子Ⅰ型受体（hTNFR1）基因克隆到pET-22b表达载体,成功构建了重组表达质粒pETH1,电转到Escherichia coli BL21（DE3）表达菌株中进行摇瓶发酵。实现了hTNFR1在大肠杆菌表达系统中的重组表达。但目的蛋白全部以包涵体的形式存在于沉淀中。为了提高hTNFR1在大肠杆菌中的可溶性表达,融合标签和分子伴侣两种策略被实施用于辅助hTNFR1的可溶性表达。结果表明,在hTNFR1的N端融合NusA标签后,hTNFR1的可溶性有一定提高;在NusA-hTNFR1基础上,过表达了7种分子伴侣,筛选出tig分子伴侣对hTNFR1蛋白可溶性表达有明显的促进作用,可溶性表达量约占总量的90％;对优化后的hTNFR1表达系统的可溶性蛋白进行Ni-NTA亲和层析纯化后,TEV蛋白酶酶切去除N端的NusA标签,结合Western blot分析鉴定,获得了大量高纯度的hTNFR1蛋白。研究结果为进一步研究hTNFR1的生理学活性及其在疾病治疗方面的应用奠定了良好基础。     

基于景观生态学“源-汇”理论的市域尺度生态功能分区——以内蒙古通辽市为例

市域尺度的生态功能分区对于市域生态资源的有效保护和合理利用起着不可替代的指导作用。现阶段较为被动而静态的功能分区研究忽视了市域生态资源在城镇化发展中的剧烈变化。而景观生态学的"源-汇"概念和相关手段,将区域生态功能空间格局与不断变化的生态过程之间建立了联系,在生态功能分区科学理性的研究实践中运用前景广阔。运用景观生态学"源-汇"理论,以内蒙古通辽市为例,通过对于研究区域中"源"景观的划分,设定不同景观要素的阻力值,构建基于"源"动态特征的最小累计阻力模型,计算得出阻力面。并进一步通过寻找阻力面突变点来确定分区阈值,最终确定通辽市域尺度生态功能的5大分区,最后提出有针对性的分区管控措施与指引。研究将市域生态要素在城市化下的动态演变与生态安全格局进行有机关联并制定科学的分区策略,为市域生态空间的优化及管理提供了理论依据。     

土地利用变化对三峡库区重庆段植被净初级生产力的影响

研究土地利用变化对区域植被净初级生产力(Net Primary Productivity,NPP)的影响对于明确区域植被固碳能力与土地利用变化的关系,以及维持生态系统结构稳定具有重要意义。以三峡库区重庆段为例,基于2000—2015年MOD17A3数据和土地利用数据,分析研究区NPP时空分布特征并从景观生态学的角度探讨土地利用变化对区域植被NPP的影响。研究表明:(1)NPP年均值16年间波动不大,空间分布上从东到西逐渐减少;(2)研究期内林地面积增加,耕地和草地面积减小,而NPP总量从25.6 TgC增加到了28.5 TgC,其中耕地NPP约占总量的44%,林地次之(40%),草地最少(14%),2000—2005年、2005—2010年、2010—2015年土地利用变化对NPP变化的贡献率分别为26.49%、59.76%、17.27%;(3)区域生态景观指数中的香农多样性指数SHDI、斑块密度PD与NPP呈正相关,而聚合度AI与NPP呈负相关,景观格局类型和景观格局变化均影响区域植被NPP的增长。要提高区域植被NPP,需优化土地利用格局,增加景观异质性和斑块密度,重视培育幼龄林,并控制成熟林的数量。     

闽三角城市群生态环境脆弱性及其驱动力

生态安全是地区社会经济可持续发展的基本前提之一,而生态环境脆弱性会威胁地区的生态安全,进行生态环境脆弱性评价具有重要意义。以闽三角城市群为例,分别选取2000年和2015年的高程、坡度、岩性、土壤类型、NDVI、年均降水量、年均温、人口密度、人均GDP、路网密度、景观多样性、土地利用程度和工业固体废弃物排放量等13个指标,基于空间主成分分析法,并结合全局Moran'I和LISA聚类图,从整体特征、空间差异、空间集聚、地类脆弱性分异以及驱动力5个方面,探讨闽三角城市群的生态环境脆弱性及其驱动力。结果表明:2000—2015年间,闽三角城市群的生态环境脆弱性整体处于中度脆弱,但呈现出由中度脆弱向重度脆弱过渡的趋势;2000—2015年间,生态环境脆弱性呈现出由东南沿海向西北内陆逐渐增强的整体趋势,并存在明显的地带性特征,东南沿海增长不明显,部分地区有所下降,而西北内陆增长明显;生态环境脆弱性存在显著的空间自相关性,且为显著正相关,在西北部山区地带为显著的高高聚集,在东南沿海平原地带为显著的低低聚集,16年间集聚性特征在空间上有所迁移和扩张;2000—2015年间,生态环境脆弱性在各地类存在着一定的异质性,其生态环境脆弱性指数大小顺序始终为:林地未利用地草地耕地水域建设用地,整体由中度脆弱向重度脆弱过渡;2000—2015年间,生态环境脆弱性的驱动力有所变化,但人口密度、景观多样性、岩性和土壤类型一直是闽三角城市群生态环境脆弱性主要的驱动力。     

引入固氮树种对辽东落叶松人工林土壤团聚体氨基糖的影响

土壤微生物残留物是稳定性碳库的重要组分,然而固氮树种引入对落叶松人工林土壤团聚体微生物残留物分布的影响还不清楚.为了阐明固氮树种对不同团聚体粒级内微生物残留物分布的影响,本研究以氨基糖作为微生物残留物的生物标识物,比较了辽东日本落叶松人工纯林和落叶松与固氮树种赤杨混交林土壤团聚体氨基糖的分布特征.结果表明: 赤杨引入不影响团聚体氨基糖的分布,但显著提高了团聚体氨基糖含量.与纯林相比,混交林土壤不同团聚体各粒级总氨基糖含量增加1.3～1.7倍.其中,混交林土壤团聚体内总氨基糖增加量的66.5%～66.9%来自氨基葡萄糖,30.0%～30.6%来自氨基半乳糖,2.5%～3.2%来自胞壁酸.赤杨引入显著提高了>2000 μm和<250 μm团聚体中的氨基葡萄糖/胞壁酸值,但不影响250～2000 μm粒级团聚体中真菌和细菌残留物的相对贡献.此外,赤杨引入增加了土壤不同团聚体内的氨基糖对土壤有机碳的贡献,但不影响团聚体粒级之间的微生物贡献,说明赤杨对微生物贡献的影响存在空间均一性.     

GLP-1-IgG4-Fc融合蛋白的表达与鉴定

将合成的人胰高血糖素样肽-1(glucagon-like peptide-1,GLP-1)突变体基因与IgG4抗体的Fc部分进行融合获得GLP-1-IgG4-Fc片段,获得的基因片段与pXC17.4载体进行连接,用电转化方法将线性化质粒稳定转染CHO-K1细胞,通过Clone Pix 2筛选出高表达细胞株,产量达1.5g/L。收集培养上清并经Protein A和Source 30Q纯化,得到的GLP-1-IgG4-Fc融合蛋白,SDS-PAGE纯度高于95%,高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)纯度和毛细管区域凝胶电泳(capillary zone electrophoresis,CZE)纯度均不低于80%,尺寸排阻层析(size-exclusion chromatography,SEC)纯度高于99%。经质谱和肽图谱测定,分子量与理论值一致,肽图谱序列与对照品高度一致。生物学活性分析表明,GLP-1-IgG4-Fc融合蛋白具有促进表达有GLP-1受体的HEK293细胞分泌环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,c AMP)的活性,并且该活性与对照品高度相似。     

基于PAT的PCV2 VLPs生产过程优化与控制研究

昆虫细胞-杆状病毒载体表达系统(baculovirus expression vector system,BEVS)是病毒样颗粒亚单位疫苗(virus like particles,VLPs)的理想生产平台。动物细胞培养过程分析技术(process analytical technology,PAT)研究的重点在于更多地获取与细胞生理状态相关的过程参数,以及实现过程敏感参数的在线表征和过程控制关键时间节点的在线判定,从而指导过程优化和控制。通过昆虫Sf9细胞的分批和补料悬浮培养,发现细胞代谢活性与在线特征频率(fc)之间存在相关性。以fc作为细胞代谢活性的在线指征,在细胞代谢活性下降之前补料,使得Sf9细胞在代谢活性明显增强的基础上,最高活细胞密度提高1.75倍。通过分批培养与补料分批培养过程细胞生理特性参数的相关性分析,发现比电容增长速率(με)与培养体系S-期细胞比例之间存在相关性,με作为细胞增殖活性状态的在线指征参数,可以作为最佳接毒时间的判定依据。此外,研究还发现在线检测参数电容(ε)与最高疫苗产量之间存在相关性,可以作为疫苗最佳收获时间的在线表征参数。以在线fc值作为补料时间指征,以在线με值作为病毒感染时间指征,以在线ε值作为病毒收获时间指征,实现了猪圆环病毒2型(PCV2)VLPs的高效生产。相比于批培养,基于PAT的生产工艺疫苗单位体积产量提高76%,生产周期缩短了24h,为PCV2病毒样颗粒亚单位疫苗大规模生产提供了一种新的高效生产模式。