A ketoreductase gene fromStreptomyces mycarofaciens 1748 DNA involved in biosynthesis of a spore pigment

An efficient plasmid transformation system forS. mycarofaciens 1748 has been established. In order to determine the function of MKR gene in S.mycarofaciens 1748, the gene disruption experiment was carried out. For this purpose the plasmid pKC1139 was used. A recombinant strain with white spore appeared, in contrast to the grey-colour spore of S.myarofaciens 1748. This suggested that homologous recombination between plasmidborne MKR gene sequence and the chromosome of S.mycarofaciens 1748 had occurred. A Southern hybridization experiment using a-³²P-labelled MKR gene as probe indicated that the desired integration event had occurred in the recombinant. The result of gene disruption showed that the alteration of this gene in the chromosome of S.mycarofaciens 1748 made sporulating colonies remain white instead of taking on the typical grey colour of sporulating wild type colonies, suggesting that MKR gene is involved in the biosynthesis of a spore pigment. The recombinant strain was incubated with fermentation medium optimised for midecamycin production. A TLC assay showed that the recombinant strain produced midecamycin in quantities comparable to that ofS. mycarofaciens 1748. A pCN8B12 was a clone from genomic library of midecamycin producing strain which contained a 28-kb DNA insert. The 28-kb DNA fragment contained act I-homologous and act III-homologous regions. he PKS (act I-homologous) and MKR (act III-homologous) genes that define spore pigment of midecamycin producing strain were Jocalized by restriction endonuclease digestion with pCN8B12, indicating that they are separated by about 10 kb DNA. The polyketide synthase gene cluster of simila; organization has not been reported yet.     

氦氖激光穴位照射对兔子宫和卵巢酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（ALP）的作用效应

用不同功率的Ｈｅ—Ｎｅ激光照射雌兔外生殖器,照射穴位,用生化方法分别测定兔子宫和卵巢的酸性磷酸酶（ＡＣＰ）、碱性磷酸酶（ＡＬＰ）的活性。激光照射后,子宫和卵巢的ＡＣＰ酶活性保持基本恒定状态,与正常对照组比较无显著差异;相反,ＡＬＰ酶活性显著提高。分析这两种酶在激光用射后表现出来的差异,作者认为是激光作用使细胞内环境改变之故,且这两种酶对Ｈｅ—Ｎｅ激光的耐受性有所不同。     

一种来源于链霉菌的纤溶酶的纯化及其基因的克隆

链霉菌C3662的发酵液上清经 80 %硫酸铵沉淀 ,DEAE Sepharose和CM Sepharose层析分离后纯化出一种纤溶酶。SDS PAGE显示为单一的条带 ,分子量约为 30kD。以 pIJ699为载体 ,S .lividansTK2 4为宿主菌 ,鸟枪法克隆纤溶酶基因 ,从 30 0 0个转化子中挑选到 1个具活性转化子 ,经亚克隆 ,序列测定得到一个 90 3bp的完整ORF ,其GC %为 68.33% ,密码子第三位GC %为 95.6% ,符合链霉菌基因的典型特征。与多种蛋白酶具有较高的同源性     

快速鉴定格尔德霉素产生菌——吸水链霉菌17997中的洋橄榄叶素

对格尔德霉素产生菌吸水链霉菌17997的发酵液乙酸乙酯提取物进行了硅胶板TLC 初步分离和NaOH溶液喷涂显色,对显红色、具有抗革兰阳性菌活性的条带进行了HPLC分析,提示抗革兰阳性菌活性化合物可能为大环二内酯类抗生素洋橄榄叶素;以dTDP-葡萄糖-4,6-脱水酶 (Tgd) 基因保守区设计PCR引物,扩增了吸水链霉菌17997基因组DNA中的tgd并进行了序列分析,表明吸水链霉菌17997含有洋橄榄叶素生物合成基因簇中的tgd基因;对NaOH溶液喷涂显红色的化合物进行LC-(+)-ESI-MS分析,证实     

麦迪霉素4"-O-丙酰基转移酶(mpt)基因结构的研究

对含有麦迪霉素4"-O-丙酰基转移酶(mpt)基因的BamHI-BamHI 8.0kb的DNA片段进行限制性酶切分析,绘制出了含有21个酶切位点的限制性酶切图谱。以含有碳霉素异戊酰基转移酶基因(CarE)的2.4kb DNA片段为探针,经Southern blot分子杂交,将mpt定位于一个EcoRI-EcoRI-Pstl 3.0kb的DNA片段上,将该片段克隆至大肠杆菌/链霉菌穿梭质粒载体pWHM3上,获得重组质粒pWFPE。含有pWFPE的螺旋霉素产生菌产二素链霉菌(S.ambofaciens)及变铅青链霉菌(J.lividans)TK24均可将内源产生的或外源加入的螺旋霉素酰化为4"-O-丙酰螺旋霉素。对EcoRI-EcoRI-PstI 3.0kbDNA片段上mpt基因进行序列分析,在该片段上有一个开放阅读框架,它以ATG为起始密码子,以TGA为终止密码子,与其序列对应的编码产物含有388个氨基酸。Mpt基因的G+C mol％为68.0,密码子第三位上G+C mol％为91.5。Mpt基因编码的氨基酸序列与CarE基因编码的氨基酸序列的相同性为67.6％,相似性为86.4％。在起始密码子上游6bp处存在…     

利用CRISPR-Cas9系统构建新型异戊酰螺旋霉素Ⅰ产生菌

异戊酰螺旋霉素(Isovalerylspiramycin,ISP)Ⅰ是必特螺旋霉素(Bitespiramycin,BT)的一种主组分,其抗菌活性与BT相似,而且作为单一组分在质控和剂型上更具优势,目前正在进行临床前研究。原有的 ISPⅠ工程菌株经过3次基因改造,已经具有2种抗性基因,很难再进行遗传操作。前期研究利用经典同源重组的方法无法构建无抗性的ISPⅠ产生菌,文中利用CRISPR-Cas9基因编辑系统在螺旋霉素(Spiramycin,SP)产生菌中成功将3位酰基化酶的基因bsm4替换为组成型强启动子ermEp~*控制下的异戊酰基转移酶基因(Isovaleryltansferase gene,ist)。删除bsm4后突变株只能产生SPⅠ组分,外源基因ist的表达产物催化SPⅠ在其4″位进行异戊酰化修饰形成ISPⅠ。经过HPLC和质谱鉴定,阳性菌株ΔEI的发酵产物中只有ISPⅠ一种ISP组分,证实新的ISPⅠ工程菌株构建成功。ΔEI菌株不带有抗性基因,可重复利用CRISPR-Cas9系统进行基因操作来获得新的改良菌株。     

多位点序列和比较基因组学分析对盐单胞菌科菌株JSM 104105的系统发育学研究

【目的】为了精准地判定产铁载体嗜盐新菌株JSM 104105在盐单胞菌科(Halomonadaceae)中的系统发育地位。【方法】采用基于16SrRNA基因、DNA促旋酶B亚基基因(DNAgyraseB subunit gene, gyrB)和核糖核酸聚合酶σ因子RpoD基因(RNA polymerase sigma factor RpoD gene,rpoD)序列的多位点序列分析方法(multilocus sequence analysis, MLSA),对菌株JSM 104105的系统发育地位进行初步分析;采用比较基因组学分析(comparative genomics analysis),分析该菌株与其系统发育关系密切的典型菌株之间的GC含量、平均核苷酸一致性(average nucleotide identity,ANI)和数字DNA-DNA杂交值(digital DNA-DNA hybridization, dDDH),并进行基因组系统发育学分析(phylogenomic analysis),更准确地判定菌株JSM 104105在盐单胞菌科中的系统发育地位。【结果】MLSA分析...     

永兴岛白穗软珊瑚共附生放线菌筛选及部分活性次级代谢产物的鉴定

【目的】从白穗软珊瑚中分离和鉴定共附生放线菌,运用PCR技术对所分离的放线菌进行I型聚酮合酶(PKS)筛选,研究其次级代谢产物。【方法】使用11种培养基对白穗软珊瑚共附生放线菌进行分离、鉴定,构建16S rRNA基因系统发育进化树,以基于I型PKS的KS基因设计的简并引物对所分离放线菌进行基因筛选,对阳性菌株用3种培养基发酵检测,对目标菌株进行放大规模发酵分离鉴定次级代谢产物。【结果】从白穗软珊瑚中分离到20株共附生放线菌,包括链霉菌属10株、迪茨氏菌属2株和盐水孢菌属8株,筛选获得18株I型PKS阳性菌株,并从菌株Salinospora arenicola SH04中分离到化合物rifamycin S和rifamycin W。【结论】首次从珊瑚共附生环境中分离得到海洋专属性稀有放线菌盐水孢菌属,并以I型PKS基因筛选为指导,分离鉴定了聚酮类化合物rifamycins,为研究软珊瑚共附生可培养放线菌的多样性和基于基因筛选指导分离次级代谢产物提供了可靠依据。