siRNA沉默socs3对红系发育的影响

为了研究细胞因子信号转导分子3(suppressor of cytokine signals-3,SOCS-3)对造血发育的影响,构建了SOCS-3慢病毒siRNA干涉载体,并转染人红白血病细胞株K562.根据绿色荧光蛋白的表达进行流式分选后,获得了高表达慢病毒干涉载体的细胞.实时荧光定量PCR和Western-blot检测了转染细胞中SOCS-3基因的干涉效率,结果显示,与对照组相比,siRNA干涉后K562细胞SOCS-3基因的表达量仅为其相对表达量的22.1%,干涉效率77.9%;Western-blot结果显示,SOCS-3在蛋白质水平表达也明显受抑制.进一步对SOCS-3基因沉默后的K562细胞进行了诱导分化,并采用联苯胺染色法检测K562细胞向红系分化比例变化,免疫荧光染色检测细胞表面抗原的变化,RT-PCR检测造血相关基因的变化.结果发现,SOCS-3沉默后K562细胞向红系的发育能力显著提高.研究结果证明,SOCS-3在造血发育中有重要调控作用,而对其表达进行干涉或沉默将在规模化的红细胞诱导研究中发挥重要作用.     

甘草GuPIP1基因启动子的克隆及序列分析

从甘草叶中提取总DNA,并用染色体步行技术克隆甘草GuPIP1基因5′端上游调控区序列（GenBank accession No．EU262597）。采用生物信息学方法进行序列分析表明,该序列具有典型的启动子结构,具干旱和ABA激素调控序列等顺式作用元件。     

80岁以上老年人冠状动脉旁路移植术合并瓣膜置换手术的临床分析

目的：总结老年患者行冠状动脉旁路移植术（CABG）合并瓣膜置换（VR）手术的特点及经验。方法：上海交通大学附属第一人民医院心血管外科2001年11月至2010年3月对60例年龄大于80的患者施行冠状动脉搭桥＋瓣膜置换手术,男33例,女27例。年龄80-87岁,平均年龄（83.77±2.45）岁。均为冠心病合并瓣膜病变患者。其中36例患者行冠状动脉旁路移植＋二尖瓣置换手术,15例患者行冠状动脉旁路移植＋主动脉瓣置换手术,9例患者行冠状动脉旁路移植＋双瓣置换手术,同时8例患者行三尖瓣成形手术,3例患者行射频消融手术,1例升主动开成形术。置换生物瓣膜者51例,置换机械瓣膜者9例。CABG平均搭桥（2.13±0.75）根,搭桥材料为左乳内动脉与大隐静脉。结果：全组早期死亡9例（15%）,1例死于术后出血,1例死于多器官功能衰竭,7例死于术后心衰。早期生存51例（85%）,出现术后并发症10例,其中2例发生胸腔积液,1例心包填塞,3例肺部感染,1例心房扑动后发生室颤,3例二次开胸止血。给予相应对症治疗后痊愈出院。门诊随访49例,随访时间1～60个月,心功能I级2例、Ⅱ级29例、Ⅲ级18例、Ⅳ级0例（NYHA分级）。结论：对老年患者行冠脉搭桥＋瓣膜置换手术,只要掌握手术适应证,充分作好术前准备、术中及术后处理,手术治疗可以取得良好效果。     

在肾癌细胞系GRC-1细胞周期不同阶段Wnt-5A基因的表达情况

Wnt基因所编码的蛋白质与许多生长因子一样具有分泌型生长因子的结构特点,其家族成员Wnt-5A是许多恶性肿瘤的自分泌生长因子,在肾细胞癌中表达显著升高.为研究在细胞周期的不同阶段生长因子Wnt-5A在转录水平的表达情况,我们采用胸腺嘧啶双阻断及高压笑气处理的方法,使肾细胞癌细胞系GRC-1细胞同步化.用半定量反转录多聚酶链反应对处于细胞周期不同阶段的细胞cDNA进行扩增,S期与G1,M期Wnt-5A mRNA表达存在差异显著(P＜0.05）.结果提示生长因子Wnt-5A在肾细胞癌的发生中具有潜在的作用,在S期作用可能尤为显著.     

可见分光光度法测定杜仲叶中的绿原酸

研究杜仲叶中绿原酸含量的检测方法。利用绿原酸和铝离子的络合显色反应,采用可见分光光度法在波长530 nm处测定杜仲叶中绿原酸量。绿原酸质量浓度在1.7×10-4~1.0×10-2g.L-1之间线性关系良好,线性相关系数为0.9995。秋、夏叶中加标回收率分别为98.0%,101.0%。该方法简便、实用、准确。     

小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件的原核表达及多克隆抗体制备

目的:用原核表达的方法获得带有6个His标记的小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件的重组蛋白,并制备其多克隆抗体。方法:利用RT-PCR技术,从小鼠心肌组织中扩增出小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件cDNA片段,将该片段与原核表达载体pET-28a连接,构建重组表达质粒pETLG1-3并转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组表达菌株。用IPTG诱导重组大肠杆菌BL21(DE3)/pETLG1-3表达,SDS-PAGE分析表明在相对分子质量60000处有特异性重组蛋白表达条带,并经Western印迹进一步鉴定。用含融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶颗粒免疫家兔,制备抗小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件多克隆抗体,ELISA方法检测抗体滴度。结果:从小鼠心肌组织中克隆了层粘连蛋白α5链LG3组件的基因,并在大肠杆菌得以表达和纯化;制备了重组蛋白的多克隆抗体,其滴度可达到1∶10240。结论:小鼠层粘连蛋白α5链LG1-3组件重组蛋白及其多克隆抗体的获得,为后续研究其功能打下了基础。     

MyD88抑制乙型肝炎病毒复制依赖活化NF-κB信号通路

目的 研究髓样细胞分化蛋白(MyD88)抗乙型肝炎病毒(HBV)效应的作用机制。方法 构建MyD88的截短突变体,获得核因子kappa B(NF-κB)超抑制剂IkBa-SR或者NF-κB信号通路激活剂IKKα/IKKβ的表达质粒,分别与HBV复制型质粒瞬时转染Huh7细胞,检测细胞上清液中HBeAg,HBsAg的表达以及胞质中HBV复制中间体DNA的含量,并以NF-κB依赖的荧光素酶报道系统检测它们活化NF-κB的程度。结果 MyD88全长蛋白和2个截短突变体M(1-151)、M(151-296)活化NF-κB的程度与其抑制HBV蛋白以及复制中间体DNA合成的能力相一致。与空载相比,表达NF-κB信号通路激活剂IKKα/IKKβ的质粒共同瞬转细胞后,转染MyD88和HBV表达质粒的细胞中NF-κB的通路明显活化,同时HBV core蛋白的合成显著降低;而NF-κB的超抑制剂IκBα-SR共同瞬转的细胞中core蛋白的表达量显著增加,检测细胞培养上清液中HBeAg和HBsAg及胞质中HBV复制中间体DNA的合成,得到相似结果。结论 NF-κB信号通路的活化在MyD88抑制HBV复制中发挥了关键作用     

C3d3通过促进脾脏B细胞高表达CXCR4增强hCGβ DNA免疫体液免疫效应

本文旨在探讨分子佐剂C3d3与hCGβ融合在基因免疫中增强抗hCGβ体液免疫效应的机制。分别用质粒pCMV4-hCGB-C3d3、pCMV4-hCGβ和pCMV4免疫BALB/c小鼠,间接ELISA法检测免疫小鼠外周血IgG/IgA类抗hCGβ抗体水平;ELISPOT分析免疫鼠脾脏组织IgG/IgA类抗体分泌细胞水平(ASC);RT-PCR分析免疫鼠脾脏B细胞趋化因子受体表达,RT-PCR和FCM分析CXCR4表达水平;RT-PCR和ELISA检测脾脏组织CXCL12表达水平。结果显示,pCMV4- hCGβ-C3d3免疫组外周血IgG类抗hCGβ抗体水平明显高于pCMV4-hCGβ免疫组;而IgA类抗hCGβ抗体水平在两组间无明显差异。pCMV4-hCGβ-C3d3免疫组脾脏组织IgG类ASCs水平明显高于pCMV4-hCGβ组;两组间IgA类ASCs水平无明显差异。经pCMV4-hCGB、pCMV4-hCGβ- C3d3免疫鼠脾脏B细胞CXCR4表达明显高于对照组;且pCMV4-hCGβ-C3d3组明显高于pCMV4-hCGβ免疫组。CXCR4~ 细胞与ASCs呈正相关,r=0.966,(P<0.05)。pCMV4-hCGβ-C3d3和pCMV4-hCGβ组脾脏组织CXC L12表达均显著高于对照组。结果表明,分子佐剂C3d3与hCGβ基因融合,在基因免疫小鼠后能够显著升调节脾脏ASCs CXCR4表达,从而可能增强抗hcGβ基因疫苗的体液免疫效应。     

聚-ε-赖氨酸高产菌株的筛选及其发酵工艺的初步研究

利用亚甲基蓝平板初筛、摇瓶复筛,从土壤中筛选了一株聚-ε-赖氨酸(ε-PL)高产菌株,ε-PL摇瓶产量大于2g/L,经初步鉴定该菌株为白色链霉菌(Streptomyces albulus)。对该菌株发酵生产ε-PL的培养基成分进行初步研究表明:葡萄糖是最好的碳源,酵母粉和硫酸铵是最佳的复合氮源,在优化培养基下,ε-PL摇瓶产量达到3.9g/L。