干酪乳杆菌L-乳酸脱氢酶在大肠杆菌中的表达、纯化及酶学性质

L-乳酸脱氢酶(L-lactate dehydrogenase,L-LDH)是发酵生产L-乳酸中催化丙酮酸转化成L-乳酸的关键酶。以干酪乳杆菌G-02(Lactobacillus casei G-02)基因组DNA为模板,克隆得到L-LDH基因(ldhL),经序列分析后将其连接到表达载体pET-28a(+)上,构建成重组质粒pET-ldhL转化到大肠杆菌BL21(DE3)中,实现ldhL基因的表达。30°C加入IPTG诱导表达后,经镍柱亲和层析纯化的重组蛋白样品通过SDS-PAGE分析,约在40 kD处出现显著的特异性条带。对表达的L-LDH生物学特异性研究显示:重组L-LDH的比酶活为1 722 U/mg,最适反应温度为40°C-45°C;果糖-1,6-二磷酸(FBP)为别构激活剂,使最适pH向中性方向偏移(pH为6.6-6.8),Mn2+可拓宽最适酶活pH范围;Mn2+、Ca2+和Mg2+对L-LDH有激活作用,而Zn2+对L-LDH有抑制作用。     

濒危物种金斑喙凤蝶的行为特征及其对生境的适应性

金斑喙凤蝶(Teinopalpus aureus)1985年被IUCN列为红色名录种,1989年被我国列为一级保护种,此后便日益受到人们关注,然而,至今为止对其野外生存、行为及生境适应等认识仍很模糊。在广西金秀县大瑶山设定4个研究区域,以线路调查法计数成虫与幼期个体数,定点跟踪观察法记录成虫交配行为、产卵行为、幼虫取食行为等。结果显示:金斑喙凤蝶主要在湿季(4—10月底,月降水量>50 mm)生长、发育与繁殖后代。金斑喙凤蝶在行为上表现出对温度的主动选择性,幼虫在17—24℃时取食行为活跃,雄蝶在19—26℃时山顶行为活跃,均表现出中温选择性;然而,雌蝶多选择在正午时刻产卵,期间温度为27—30℃,表现出高温选择性。雄蝶活动对生境地形表现出主动选择性,(87.34±7.58)%(n=339)的雄蝶选择飞向山顶,他们每日上午6:00至11:00在山顶聚集,绕圈飞行或停息,而以山顶停息为主,占山顶活动时间的(77.87±19.32)%。雄蝶通常停息在山顶的高枝位叶片上或山顶周缘的叶片上,以便迅速发现并拦截飞经的雌蝶,获得交配机会。因而,金斑喙凤蝶在交配策略上主要采取雄蝶等候的方式。停息期间,雄蝶表现出明显的占区行为,首先停息在某一区域的雄蝶在领域权竞争中通常都是最后的胜利者,赢得领域,获得更多交配机会。野外观察发现,金斑喙凤蝶的天敌种类较多,野外存活率偏低,最后羽化率仅为38.9%(n=20)。对于存活个体而言,他们已明显进化形成一套复杂的防御体系,主要包括由保护色、颜色拟态、形状拟态等组建的初级防御体系和由眼斑展示、身体晃动、Y-腺伸出等组建的次级防御体系。另外,老熟幼虫多选择在林下层的灌木丛或竹丛的隐蔽枝条上化蛹,化蛹高度为(1.82±1.58)m(n=20),这种对化蛹场所的主动选择行为可提高其蛹期的防御能力。研究结果说明,在自然选择作用下,金斑喙凤蝶对其阔叶林生境的适应性行为特征非常明显,然而,生境破坏(砍伐等)或人类强度干扰(林下层垦殖等)将使这些适应性行为失效,并威胁到该珍稀蝴蝶种群的繁衍生息,甚至导致局部灭绝的发生。     

以胸痛为主要表现的胃食管反流病36例临床分析

目的：探讨以胸痛为主要表现的胃食管反流病的病因、临床特点及诊治方法。方法：选择本院近年来诊治的36例已排除心源性及食管器质性病变,诊断为胃食管反流病的胸痛患者,予以埃索美拉唑20mg,每日两次;吗叮林10mg,每日三次治疗8周,观察其疗效并分别于2周,4周,8周记录症状缓解情况。结果：经抗反流治疗8周后,30例（83.33%）胸痛完全消失,4例（11.11%）明显缓解,2例（5.56%）无效,总有效率达94.44%。胸痛症状在治疗2周后积分下降不明显,而治疗4周,8周后显著改善,与治疗前比较有显著性差异（P〈0.01）。结论：胃食管反流病病因复杂、临床表现多样易误诊漏诊,胃镜检查结合24小时食管动态ph监测,必要时给予质子泵抑制剂试验性治疗可提高本病的确诊率。     

干旱和臭氧浓度升高对元宝枫早生和晚生叶片色素和脱落酸含量的影响

臭氧和干旱是威胁我国北方城市植物生长的两大重要因素。于2012年利用开顶式气室,通过设置4个处理(AW-大气环境和水分充足;AW+60-大气增加60 nL/L臭氧+水分充足;AD-大气+干旱处理;AD+60-大气增加60 nL/L臭氧+干旱处理),开展了大气臭氧浓度升高(以下简称"臭氧")和干旱对元宝枫秋季变色期主要色素含量及脱落酸(ABA)含量的影响研究。结果表明:(1)早生叶在臭氧处理后,总叶绿素和类胡萝卜素分别下降了21%和29.6%、花青苷和类黄酮相对含量显著升高了34.1%和7.3%、脱落酸含量增加了19.8%。干旱处理后,早生叶总叶绿素显著下降了18.7%、花青苷和类黄酮相对含量分别显著升高了37%和7.4%、脱落酸含量显著升高了13%。叶片的上述生理变化将会导致叶片提前变红、叶片早衰和提前脱落。(2)晚生叶在干旱处理后总叶绿素含量减少了18.8%,脱落酸含量增加了33.4%,臭氧以及与干旱共同处理未对晚生叶产生显著影响。(3)臭氧和干旱共同处理后,早生叶总叶绿素含量、花青苷和叶片脱落酸含量存在显著交互作用,交互作用缓解了叶片总叶绿素的下降和花青苷的上升,但未缓解叶片脱落酸含量的增加。综上,早生叶和晚生叶对臭氧和干旱处理的响应不同,早生叶对臭氧处理响应大于晚生叶,而晚生叶对干旱更敏感。臭氧和干旱处理均加速了叶片衰老,二者共同处理后叶片脱落风险增加。     

转基因欧洲黑杨中Bt基因表达特性的研究

利用PCR检测了转基因欧洲黑杨当代和杂交后代群体 ,外源Bt基因在 7年生的转基因欧洲黑杨 1 4个无性系中稳定存在 ,Bt基因在杂交后代中分离比例为 1∶1。转基因欧洲黑杨作母本进行杂交时有落花、落果现象 ,可能是基因改造影响了它们的某些生理功能。     

细胞核CaMK和Calcineurin 对大鼠心肌肥厚发生的作用

目的:研究大鼠心肌肥厚时,钙依赖的蛋白激酶和蛋白磷酸酶在心肌细胞膜、细胞浆和细胞核的分布规律,以探讨核钙信号与核反应在心肌肥厚发生过程中的病理生理意义.方法:制备腹主动脉缩窄大鼠心肌肥厚模型,同位素32P掺入法分别测定心肌细胞核、细胞浆和细胞膜的蛋白激酶活性及用无机磷生成显色法测定其蛋白磷酸酶活性.结果:腹主动脉缩窄术后4周大鼠心肌显著肥厚,伴有明显的血液动力学异常.与正常对照组相比较,腹主动脉缩窄心肌肥厚组心肌细胞核钙调素蛋白激酶(CaMK)活性增加101.1%(P＜0.01),其膜的酶活性升高40.2%(P＜0.01),而胞浆的酶活性不变(P＞0.05);心肌细胞核钙调神经磷酸酶(Calcineurin)活性增加43.6%(P＜0.05),膜和胞浆中其活性增加无显著性(P＞0.05).正常组和腹主动脉缩窄心肌肥厚组心肌细胞CaMK和Calcineurin活性分布为核＞膜＞胞浆(P＜0.01).结论:腹主动脉缩窄心肌肥厚时核内钙依赖的CaMK和Calcineurin活性增加,提示压力超负荷时细胞核内钙调节的蛋白磷酸化和去磷酸化水平增高,可能在介导心肌肥厚的发生中起重要作用.     

mirRNA-17-5p抑制物对骨肉瘤细胞系SOSP_9607增殖和凋亡的影响

目的:探讨miR-17-5p抑制物对于骨肉瘤细胞系SOSP_9607细胞增殖和凋亡的影响.方法:四甲基偶氮唑蓝(MTT)法测定细胞增殖,进一步计算抑制率,流式细胞仪测定细胞凋亡.将SOSP_9607细胞分为对照组和实验组,对照组分为阴性对照和正常细胞对照组.实验组采用miR-17-5p抑制物(hsa-miR-17-5p inhibitors)抑制SOSP_9607细胞内miR-17-5p的活性.结果:与对照组相比,实验组显著抑制SOSP_9607细胞的增殖,有明显的剂量依赖性(P<0.01).随着浓度从50 nmol/L逐渐增加至200 nmol/L,抑制率逐渐增高(P<0.01).实验组凋亡率(9.6±1.8)%与阴性对照组凋亡率(3.5±0.4)%相比明显增高(P<0.01).结论:miR-17-5p抑制物通过抑制SOSP_9607细胞中miR-17-5p的活性对SOSP_9607细胞的增殖和凋亡发挥重要作用.     

RNA干扰抗病毒感染

RNA干扰是由双链RNA诱导的、关闭同源序列基因表达的机制。它是一种自然存在于植物、线虫、果蝇等真核细胞生物中的抵抗病毒感染方式。随着在哺乳动物细胞培养中成功地诱导RNA干扰,利用RNA干扰预防、治疗病毒感染已成为新的研究热点,并取得了有希望的成果。在未来,有望成为抗病毒感染的有效方法。     

人松弛素原样蛋白H2在大肠杆菌中的表达、分离纯化及鉴定

利用聚合酶链式反应方法 ,从含有人前松弛素原cDNA基因的质粒 pMALp2X-hRLXH2上得到人松弛素原H2的编码基因 ,亚克隆到温度诱导型原核表达载体pBV2 2 0上 ,转化大肠杆菌DH5α细胞。经 4 2℃温度诱导 ,获得了目的基因的高效表达。目的蛋白质以包含体的形式存在于大肠杆菌细胞中。菌体经过超声波破碎 ,包含体裂解 ,蛋白质的体外变性还原 ,复性 ,SephadexG 75凝胶过滤层析 ,反相快速蛋白质液相层析等一系列分离纯化过程 ,得到了高纯度的重组Met 人松弛素原样蛋白H2 ,得率约为 2～ 3mg/L。对纯化的目的蛋白质进行了SDS PAGE电泳纯度分析 ,氨基酸组成分析 ,通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法测得目的蛋白质的分子量为 183 90 .4 (理论计算值为 183 92 .3 )。     

锦鲤4个人工雌核发育家系的微卫星标记研究

利用Crooijmans et al.(1997)分离的包含CA重复单元的普通鲤鱼（Cyprinus carpio L.)的8个微卫星DNA标记,对从锦鲤（Cyprinus carpio L.)的红白,大正和昭和3个不同品系中所获得的4个不同人工雌核发育家系的20尾个体进行PCR扩增。电泳结果表明,8对引物在20尾个体中均能重复稳定地扩增出相应的同源序列。随引物不同,各等位基因数为1－11个,大小在68－264bp。在MFW4,MFW7,MFW19,MFW20,MFW23和MFW24 6个微卫星的扩增结果中,20尾个体的扩增图谱呈现了高度的遗传多态性,不同雌核发育家系内个体的遗传异质性也较大。其中大正（TaS)和红白1（RW1）的个体不仅花色分化显著,而且个体间的平均遗传距离分别高达0．28。通过对微卫星等位基因和基因型分析发现,由于锦鲤品系中的每一个体是通过不断地杂交选育而获得,基因组来源复杂,基因高度杂合。因此,只进行1代的人工雌核发育,其家系内仅部分个体的部分座位出现纯合。所获得的人工雌核发育锦鲤为后续的色素遗传调控机制研究提供了必要的实验材料;同时,所鉴定的微卫星分子标记为进行锦鲤的分子标记育种的基因组作图提供了理想的工具。