C 族GPCRs 的半胱氨酸富集区的研究进展及药学意义

C族GPCRs是体内重要的受体,参与众多重要的生理和病理进程,并具有复杂的结构和激活机制。在体内该族受体形成组成性的二聚体并具有七螺旋跨膜结构(heptahelical transmembrane domain,HD)、捕蝇草模块(venus flytrap domain,VFT)和半胱氨酸富集区(cysteine-rich domain,CRD)。本文系统介绍了近年来CRD单体的序列和结构解析,以及参与受体激活过程的机制研究的历程和进展。同时也展望了这些基础研究成果对于开发新的更具有成药性的以C族GPCRs为靶点的变构剂的指导意义。     

联合应用NGF 和胰岛素对糖尿病大鼠烫伤创面表皮干细胞的影响

目的:通过局部联合应用神经生长因子和胰岛素对糖尿病大鼠深II度烫伤创面表皮干细胞标记物β1整合素和角蛋白19(K19)表达的影响,探讨神经生长因子和胰岛素联合应用于糖尿病烫伤创面治疗后对创面愈合的影响。方法:雄性wistar大鼠腹腔注射链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病模型60只,1月后在大鼠背部造成深II度烫伤。将大鼠随机分为糖尿病对照组(B)、胰岛素治疗组(C)、神经生长因子治疗组(D)、神经生长因子联合胰岛素治疗组(E),每组15只。另取15只正常雄性wistar大鼠作为正常对照组(A)。观察伤后3、7、11、15、21 d各组创面愈合情况,检测创面β1整合素和角蛋白19(K19)的表达并计算创面愈合率。结果:E组创面愈合率自第7天起较A、B、C、D组增加,为[(25.33±2.32)%,(P<0.05)];A、C、D组创面愈合率较B组增加分别为[(22.51±1.78)%,(16.68±1.95)%,(18.29±1.70)%,(P<0.05)]。E组整合素β1和角蛋白19(K19)表达自伤后第7至21天各时相点显著增加,(P<0.05)。结论:糖尿病大鼠深II度烫伤创面局部联合应用神经生长因子和胰岛素可促进表皮干细胞的增殖与分化从而加速创面的愈合。     

盐碱地土壤微生物对不同改良方法的响应

实验室条件下分别模拟客土改良、排水改良、生物(苜蓿)改良等3种常用的盐碱地改良方法,以菜园土壤和盐碱土(未改良的原始土)作为对照,研究了土壤微生物生态特征对不同改良方法的响应。结果显示:①土壤微生物区系及生理生化指标均对不同改良方式有良好的响应,其中土壤脲酶活性随土壤盐碱胁迫加剧而提高;②3种改良方式中,客土法在短期内最能改善土壤微生物各指标,依次是排水法、生物法;③排水法对土壤微生物生态状况不利;④生物法对于改善土壤微生物生态状况速度相对较慢,但因其克服了客土法、排水法显见的缺点,相对有更好的应用前景。     

猪IGF2基因外显子3的遗传多态性及遗传效应分析

采用PCR-SSCP方法检测猪胰岛素样生长因子2 (insulin-like growth factor 2,IGF2)基因外显子3多态性,分析其对初生重、断奶重、6月龄重和背膘厚的遗传效应.根据猪IGF2基因的DNA序列（AY044828）设计引物,结果在其扩增片段上检测到多态性,对纯合子进行测序,发现IGF2-ex3-A36T和IGF2-ex3-G109A两个多态性位点,并且这2个多态性位点完全连锁,检测到3种基因型（A36A/G109G,A36T/G109A 和 T36T/A109A）.统计结果表明,基因型在各品种中分布不一致,长白猪和大白猪与莱芜猪、大薄莲猪、沂蒙黑猪和里岔黑猪比较基因型分布差异极显著（Ｐ<0.01）;其它猪种间基因型分布差异均不显著（Ｐ>0.05）.固定效应模型分析结果表明,初生重和背膘厚基因型间差异显著（Ｐ<0.05）,而断奶重和6月龄重基因型间差异不显著（Ｐ>0.05）.最小二乘分析结果表明,A36A/G109G基因型个体同A36T/G109A和 T36T/A109A基因型个体比较初生重和背膘厚的差异显著（Ｐ<0.05）,3种基因型初生重的大小排列顺序为A36A/G109G < A36T/G109A < T36T/A109A,背膘厚的大小排列顺序为A36A/G109G > A36T/G109A >T36T/A109A.因此,推测IGF2基因对个体的初生重和胴体瘦肉率存在一定的影响,将IGF2基因应用于猪育种过程中的标记辅助选择,将可以改善猪肉品质,加快猪的育种进程.     

米非司酮调控的单链鼠白介素12真核表达载体的构建及鉴定

构建含有单链鼠白细胞介素12(mIL-12)基因,并可经米非司酮调控表达的真核载体,在体外鉴定其调控表达效果.用PcR技术从GCp35Ep40PN质粒上获取白细胞介素12的p40和p35亚基的基因,通过2次PCR技术引入linker后得到单链白细胞介素12基因,将其与米非司酮诱导调控系统克隆入pDC312质粒,构建成真核表达载体pDC-RumIL-12,通过限制性内切酶和PCR鉴定其正确性.在体外用脂质体转染法将pDc-RumIL-12载体转染HEK293细胞株,以不同的剂量米非司酮诱导载体表达,然后用ELISA法检测培养液上清中mIL-12蛋白的含量.测序结果表明所得鼠白细胞介素-12融合单链基因序列与设计相一致.酶切分析和PCR证实载体pDC-RumIL-12构建正确.将pDc-RUmlL-12转染HEK293细胞并经米非司酮诱导表达后,ELISA检测结果表明该栽体有良好的调控能力.没有诱导剂米非司酮时,只有极少量的mIL-12蛋白表达,而加入诱导剂米非司酮后,mIL-12表达量明显增加,并在一定范围内与米非司酮剂量呈正比.成功构建了含有单链鼠白细胞介素12(mIL-12)基因,并可经米非司酮调控表达的真核栽体,可用于肿瘤的基因治疗研究.     

杜氏盐藻RuBisCO小亚基基因的克隆和分析

根据莱菌衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、团藻(Volvox carteri)、伞藻(Acetabularia cliftonii)等生物的1,5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(RuBisCO)的小亚基rbcS基因氨基酸的高度保守序列,设计一对简并引物,进行RT-PCR.209 bp的PCR产物经测序分析及进行氨基酸序列同源性比对,表明克隆的序列为盐藻rbcS基因的cDNA片段.根据该序列信息,采用RACE(rapid amplification of cDNA ends) 方法扩增其5'上游未知区和3'下游未知区.5'RACE得到的cDNA长度为约300 bp,3'RACE得到的长度约380 bp.三段序列拼接后cDNA全长为878bp,其中开放读码框包括190个氨基酸.此cDNA序列,推导成氨基酸序列与已知物种的rbcS基因相比对,同源性分别为V.carteri 78%,C.reinhardtii 75%,A.cliftonii 67%,据此可推断所克隆的序列为盐藻RuBisCO的小亚基cDNA序列,GenBank收录号为AY739272.     

Myostatin三维结构模建及分子进化分析

Myostatin(MST)为肌肉生长负调节因子,其功能受抑制可导致肌肉量增加.对MST核酸序列进行序列比对,构建进化树;采用同源模建方法首次模建MST成熟肽生物活性二聚体的四级结构,并预测MST与其受体ActRIIB的相互作用模式.进化树将肌肉生长抑制素基因(MSTN)分成4个亚家族:哺乳动物MSTN,鸟类MSTN以及鱼类MSTN 1和2.MST受纯化选择作用,在不同物种的直系同源基因具有较高的刚源性,其中哺乳动物、鸟类MST C端活性肽氨基酸序列高度保守.表明哺乳动物、鸟类MST的结构、功能类似,且信号传导路径可能一致;而鱼类MST的调控机制可能存在较大差异.MST结构及其表面静电势和疏水氨基酸分布表明静电力和疏水相互作用在MST与其受体结合过程中可能起到十分重要的作用.     

siRNA抑制c—myc基因的表达对宫颈癌细胞增殖的影响

目的：利用siRNA（small interference RNA）技术研究C-myc基因的对宫颈癌HeLa细胞增殖的影响。方法：依据Promega公司在网上提供的设计软件,设计针对C-myc基因的siRNA,合成DNA模板,体外转录合成siRNA。通过阳离子聚合物jet—SITM—ENDO将合成的siRNA转染入HeLa细胞,以未转染细胞以及错义序列siRNA—scr转染细胞为对照。用细胞计数法检测siRNA对HeLa细胞增殖的影响。流式细胞法检测细胞周期及蛋白表达的变化,RT—PCR法比较转染前后C-myc mRNA表达水平的变化。结果：细胞计数法结果显示,转染24h后c-myc基因siRNA明显抑制MCF-7细胞增殖,转染48h后,抑制效率稳定。c-myc基因siRNA转染后能有效地抑制HeLa细胞的增殖,阻滞细胞周期于G0／G1期,siRNA转染组c-myc mRNA、蛋白的表达量明显低于空白对照组、错义序列组。结论：体外转录合成的siRNA可有效降低HeLa细胞c-myc基因的表达,抑制细胞增殖。     

不同能源柳无性系对土壤镉污染的抗性研究

运为了比较不同能源柳无性系对土壤镉抗性的差异,采用盆栽方法,设置土壤镉含量5个梯度(0、10、20、40、80 mg·kg^-1),以乡土旱柳为对照,对能柳1、能柳2、能柳E、能柳C的扦插幼苗对土壤镉污染的生理生态反应进行了系统测定,分析了不同无性系的抗性。结果显示,低浓度处理（≤20 mg·kg^-1）促进苗木生长,其中能柳2在10 mg·kg^-1处理下根和单株生物量增幅最大,可达到对照的132.0%和120.0%;随着镉浓度的增加,生长量下降,在最高浓度处理下,能柳C生长量降低最少,根、枝、叶和单株生物量分别为对照的86.1%、85.3%、82.9%、84.9%,旱柳的枝、叶生物量降低最多,为对照（无镉）的43.8%、45.0%,而能柳1的根、单株生物量降低最多,仅为对照的36.1%、44.4%;随着镉浓度的增加,不同能源柳无性系叶片的SOD、POD、CAT活性和根系活力基本呈现先升后降的趋势,其中,CAT活性变化较为平缓;关于SOD活性和根系活力,能柳1、能柳2在20 mg·kg^-1时已显著下降,旱柳在40 mg·kg^-1时显著下降,而能柳E、能柳C在40 mg·kg^-1时才显著下降。采用隶属函数对5个无性系在镉胁迫条件下的生长和酶指标进行综合分析,不同无性系对土壤镉污染的抗性顺序为能柳C>能柳2>能柳1>旱柳>能柳E。不同无性系对镉均有抗性,都可在镉污染区推广种植,栽培中,应根据土壤污染和绿化目标,做出适当选择。     

固相微萃取—气相色谱—质谱联用分析蓼实挥发性成分

察了萃取样品温度、萃取纤维吸附时间等因素对于固相微萃取蓼实挥发性成分的影响,确定较佳的实验条件为：萃取样品温度60℃,萃取纤维吸附时间60 min,脱附温度250℃,脱附时间5 min。用气相色谱—质谱联用技术测定上述条件所得蓼实挥发性化学成分,并鉴定出其中43种,占总峰面积的76.73%。其中含量较高的物质有：罗汉柏烯 (6.99%),丁香烯 (5.59%),2,5,5,8 a-四甲基-6,7,8,8a 四氢-5H-萘-1-酮(5.52%),α-丁香烯(4.29%),1,2,4a,5,6,8a-六氢-4,7-二甲基-1-异丙基萘(4.04%),环氧石竹烯(3.60%),α-香附酮(3.54%),4,5,5a,6,6a,6b-6氢-4,4,6b-三甲基-2-乙烯基-2H-环丙香豆酮(3.54%),香叶基丙酮(3.48%)。