小麦磷酸丙糖转运器的特性及其对同化物分配的调节

磷酸丙糖转运器(tnose phosphate/phosphatetranslocator,TPT)是源、库间光合产物分配的第一调控部位,研究TPT的特性及其对同化物分配的调节,对于提高光合作用同化物利用效率有着重要意义.我们首先采用Percoll密度梯度离心从小麦(Triticum aestivum L.)叶片中分离制备了完整性达91%以上、具有较高纯度的完整叶绿体.利用TPT不可逆抑制剂[H3]2-DIDS标记和SDS-PAGE,以及小麦TPT抗体进行Western blotting分析,证明TPT蛋白仅存在于叶绿体被膜中,约占被膜总蛋白的15%,其分子量为35 kD,而在液泡膜和线粒体膜上不存在.采用硅油离心法研究TPT对磷酸二羟丙酮(dihydroxyacetone phosphate,DHAP)、磷酸烯醇式丙酮酸(phosphoenolpyruvate,PEP)、葡萄糖-6-磷酸(glucose-6-phosphate,G6P)与Pi的反向运输动力学的结果表明,DHAP/Pi的最大运输活性最高,PEP/Pi次之,G6P/Pi最低.TPT与这些运输底物的Km值由小至大,分别为DHAP、Pi、PEP和G6P,证明TPT的最适运输底物为DHAP.用DIDS处理时,TPT对DHAP运输活性的抑制达95%.TPT运输活性受到抑制时,可导致叶绿体内大量积累淀粉.TPT在调控小麦叶绿体同化产物的分配中起着重要作用,在保证卡尔文循环正常运转的前提下,通过TPT外运到胞质中参与蔗糖合成和其他代谢活动的磷酸丙糖(triose phosphate,TP)约占93.6%,而用于叶绿体内合成淀粉的TP仅占6.4%.生理条件下其功能是高效率地把大部分光合同化产物TP及时运出叶绿体到胞质中,用于合成蔗糖并运输到其他库器官的需要.     

QS系统中LasR和RhlR蛋白对铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响以及免疫原性研究

为探讨铜绿假单胞菌 PAO1 中 lasR 和 rhlR 基因表达产物的分子生物学特性,研究它们对铜绿假单胞菌生物被膜形成的影响以及对小鼠的免疫保护效果,采用聚合酶链式反应 (PCR) 方法扩增铜绿假单胞菌标准株 PAO1 中的 lasR 和 rhlR 基因,全自动荧光测序仪测序,并用 Blast 方法检测克隆片段. 利用 pGEX4T-1 载体分别构建 lasR/rhlR-pGEX4T-1 重组质粒,在大肠杆菌 BL21(DE3)中诱导表达,并经过免疫印迹实验验证其生物学活性. 用硅胶膜培养法建立生物被膜模型,诱导转入了pGFPuv 质粒的铜绿假单胞菌 PAG0305 形成生物被膜,并测定 LasR 蛋白和 RhlR 蛋白对生物被膜形成的影响. 同时用纯化的重组蛋白免疫小鼠,菌落计数法检测免疫组和对照组鼠肺对铜绿假单胞菌的清除率. 以 PAO1 染色体 DNA 为模板的 PCR 结果显示,lasR 的全基因序列为 720 bp,rhlR 基因序列为 726 bp,经序列分析和同源性比较分别与 GenBank 中 lasR/rhlR 基因(登录号:M59425; AE004768) 的同源性为 100%. 大肠杆菌 BL21 (DE3) 分别转化重组质粒 lasR/rhlR-pGEX4T-1 后,经 IPTG诱导和 SDS- 聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,表达的融合蛋白分子质量均为 54 ku 左右,与预期蛋白质分子质量相同. 荧光显微镜观察和测定结果表明,在硅胶膜上 PAG0305 能够形成典型的发荧光的生物被膜,LasR 或 RhlR 蛋白 (10 mg/L) 存在的情况下,PAG0305 生物被膜的形成速度在前三天比对照组平均提高 40.77%,而且两蛋白单独存在与同时存在时的作用相同. 体内实验中,免疫小鼠肺部对铜绿假单胞菌的清除率显著高于未经免疫的正常组 (P < 0.05). 上述结果表明:构建的lasR/rhlR-pGEX4T-1 重组质粒能够在大肠杆菌 BL21(DE3)中成功地表达并具有生物学活性. LasR/RhlR 蛋白在体外模型中能够加快铜绿假单胞菌生物被膜的形成速度,是调节铜绿假单胞菌生物被膜形成的重要因素之一. 免疫结果表明,重组蛋白对小鼠表现出一定的保护作用,这为进一步开展疫苗研究奠定了基础.     

汉坦病毒囊膜糖蛋白G1基因重组腺病毒载体的构建及其在Vero E6细胞中的表达

拟构建汉坦病毒Gl基因重组腺病毒载体并在VeroE6细胞中表达,为汉坦病毒基因疫苗的研究提供实验基础。PCR法从含汉坦病毒-76118株M基因的M56质粒扩增糖蛋白G1基因片段,利用穿梭质粒pShuttle,将其克隆入Adeno—X病毒DNA,获得重组腺病毒DNA,转染HEK293细胞,包装、扩增后得到汉坦病毒Gl基因重组腺病毒原种,感染VetoE6细胞,用IFA法和ELISA法检测表达产物。得到了含汉坦病毒G1基因的重组腺病毒,其滴度约为10^11pfu／ml,感染VeroE6细胞后检测到汉坦病毒糖蛋白G1的表达。     

Potential high-frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR/Cas9 in <Emphasis Type="Italic">Arabidopsis</Emphasis> and its prevention

Key message

We present novel observations of high-specificity SpCas9 variants, sgRNA expression strategies based on mutant sgRNA scaffold and tRNA processing system, and CRISPR/Cas9-mediated T-DNA integrations.

Abstract

Specificity of CRISPR/Cas9 tools has been a major concern along with the reports of their successful applications. We report unexpected observations of high frequency off-target mutagenesis induced by CRISPR/Cas9 in T1 Arabidopsis mutants although the sgRNA was predicted to have a high specificity score. We also present evidence that the off-target effects were further exacerbated in the T2 progeny. To prevent the off-target effects, we tested and optimized two strategies in Arabidopsis, including introduction of a mCherry cassette for a simple and reliable isolation of Cas9-free mutants and the use of highly specific mutant SpCas9 variants. Optimization of the mCherry vectors and subsequent validation found that fusion of tRNA with the mutant rather than the original sgRNA scaffold significantly improves editing efficiency. We then examined the editing efficiency of eight high-specificity SpCas9 variants in combination with the improved tRNA-sgRNA fusion strategy. Our results suggest that highly specific SpCas9 variants require a higher level of expression than their wild-type counterpart to maintain high editing efficiency. Additionally, we demonstrate that T-DNA can be inserted into the cleavage sites of CRISPR/Cas9 targets with high frequency. Altogether, our results suggest that in plants, continuous attention should be paid to off-target effects induced by CRISPR/Cas9 in current and subsequent generations, and that the tools optimized in this report will be useful in improving genome editing efficiency and specificity in plants and other organisms.

     

用SSR分子标记研究大豆属种间亲缘进化关系

利用SSR标记技术对大豆属11个种37份材料的遗传多样性进行分析,不同位点在种间的等位基因数为6－29,平均生个位点15．9个等位基因,Soja亚属的等位基因数是Glycine亚属的71．5％,并且Glycine亚属种间指纹 谱的差异大于Soja亚属种间的指纹图谱,SSR等位基因的主成分分析结果表明,大豆属中的Glycine亚属和Soja亚属的分类界限是比较明确的,利用第一主成分和第二主成分可较明显地区分开Glycine 亚属的分类界限是比较明显的,利用第一主成分和第二主成分可较明显地区分开Glycine亚属和Soja亚属,通过UPGMA方法构建了大豆属11个种的遗传进化关系,Soja亚属中G.max,G.soja和G.gracilis3个种在系统分化树上界限是比较明显的,由此看来这3个种是独立存在的。     

F肌动蛋白作为胞间连丝组分的结构与生理学证据

以蒜(Allium sativum L.)瓣鞘外表皮为材料,利用荧光特异探针与共焦镜检术,结合透射电镜与免疫金标记对表皮细胞间胞间联络的性质、结构进行了系统观察.结果表明,加厚壁上的通道是由狭长的管状胞质和初生纹孔场上成束的胞间连丝衔接组成,前者实为原生质体的一部分.单个胞间连丝的孔径为60～70 nm,属正常胞间连丝范围,它们乃相邻细胞间共质联系的所在.荧光探针TRITC-Phalloidin (TRITC-Ph)标记的结果显示,整个通道上呈现红色荧光的纤索在接近初生纹孔场处明显变窄,与超微结构观察中所见的结构特点相吻合,共焦镜下观察到的初生壁上的荧光亮斑乃初生纹孔场中成束胞间连丝被标记的反映,从而有效地证实了F肌动蛋白在常态胞间连丝上的存在.免疫金标记实验显示在管状胞质中和胞间连丝上有金颗粒分布,这一结果为证实荧光标记物具肌动蛋白性质提供了有说服力的补充.     

保卫细胞钙信号的研究进展

钙(Ca2+)是多种信号途径的第二信使。Ca2+成像技术的成熟和发展为显示保卫细胞胞 质Ca2+浓度（［Ca2+］cyt）的分布及外界刺激引起［Ca2+］cyt的变化模式提供了很好的研究工具,关于细胞内外Ca2+库释放Ca2+的机制也有了较清楚的认识。拟南芥突变体的研究使Ca2+ 信号上游分子及其排序更加明确,［Ca2+］cyt增加下游的磷酸化和去磷酸化 过程也是气孔关闭必需的生理过程。